新型E3泛素连接酶抑制剂高通量筛选试验

应用：肿瘤
基本原理：
泛素-蛋白酶体系统在多种细胞事件的调节中发挥重要作用，其失调可能导致疾病的发生，尤其是肿瘤的发生。硼替佐米/万珂为蛋白酶抑制剂，已被批准用于治疗多发性骨髓瘤。E3泛素连接酶与经典的E1、E2酶功能一致，募集特定的底物，并协调其泛素化状态以及随后的蛋白酶降解或细胞活性改变。E3连接酶与包括肿瘤在内的一系列病症相关，因此，在药物开发中快速经济地检测其活性是十分可取的。适用于E3连接酶的高通量筛选试验的相对缺乏已大大阻碍了E3的抑制剂的开发，并减缓了这个关键领域的药物研究。该方法描述了一种新型适用于E3连接酶试验的平台，该平台利用了泛素链中泛素结合结构域的固有亲和力的优势，允许对E3连接酶依赖的泛素链形成的分析。该方法已成功应用于RING和HECT家族，表明该平台在分析E3连接酶时的广泛应用。

方法、材料
除非另有说明，所有试剂均购自Sigma公司（圣路易斯，密苏里州），且所有试剂级至少为试剂级或更好。质粒编码Ube1，MuRF1 ，Hrd1的cDNA购自Open Biosystems公司（汉茨维尔，AL ）。
克隆和蛋白表达：

表达SUMO化UBA2酶，包括Rad23 (残基351-398), 仅K48泛素化 (K6R, K11R, K27R, K29R, K33R, and K63R), 6His-Ube1, 6His-UbcH5b, 6His-UbcH5c, 6His-UbcH7, SUMO-CARP2, SUMO-CARP2 (H333A), SUMO-MuRF1, 6His-E6AP和 SUMO-Hrd1 (残基235-617)，的大肠杆菌BL21 (DE3)的克隆、表达、纯化均按标准的分子生物学技术操作，并且使用SUMOpro融合载体（ LifeSensors公司，宾州，Malvern）。所有构建的结构均完全测序，以验证其野生型序列或检查引入的点突变。

E3连接酶的UBA自动泛素化实验

96孔中等结合板（赛默飞世尔科技，罗克福德，IL ）在洗涤及3%牛血清白蛋白阻断之前，用纯化的SUMO化UBA2酶孵育。SUMO化UBA2酶通过疏水相互作用被动吸附从而被非特异固定。在一个典型的检测，每孔由不同浓度的E3连接酶与5nM Ube1、100nM E2和1.1 μM K48泛素化一起构成的50μL反应缓冲液（ 50mM Tris-HCl [pH值8.0], 5mM MgCl2，0.2mM ATP，1 mM β-巯基乙醇）孵育。室温孵育一段固定时间（在最初的线性范围内）后，用洗板器(BioTek, Winooski, VT)0.1%PBST洗3遍。5%牛血清白蛋白/PBST稀释的抗泛素兔抗（稀释度 1:50）(Sigma)及FITC/HRP标记的兔二抗（稀释度 1:10,000）(ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)连续孵育1小时，且每次孵育后用PBST洗板。所有散装试剂的称量均由微量称量仪称取(BioTek)。泛素化产物的相对水平通过使用ECL (Millipore, Billerica, MA)由发光酶标仪(EnVision, PerkinElmer, Waltham, MA)读取。类似的试验也被用于E1和E2的优化，E1或E2系列稀释的酶用于检测饱和信号，以保证没有限速条件。这个技术平台由LifeSensors公司开发(www.lifesensors.com)。

泛素链识别试验

在预先包被SUMO-UBA2及牛血清白蛋白封闭的96孔板中，由单体泛素或泛素链2-7(Boston Biochem, Cambridge, MA)等构成的50ul反应体系在室温下孵育30min，用洗板器PBST洗3遍。泛素链识别的检测如上所述。

基于凝胶的体外自动泛素化试验

剂量范围内的SUMO-CARP2与含5 nM Ube1和100 nM UbcH5c的反应缓冲液一起在室温下孵育20min，随后，反应液在变性条件下通过SDS-PAGE分离开，接着转移至硝酸纤维素膜上，沸水中放置5min，用5%脱脂牛奶/PBST封闭，随后用兔抗泛素一抗(Sigma)及HRP标记的兔二抗标记(Jackson ImmunoResearch Laboratories)，使用ECL试剂(Pierce, Rockford, IL)在数码成像仪中观看结果。

表观Km值测定

SUMO-UBA2预包被及牛血清白蛋白预封闭的96孔板准备方法如上。一系列稀释度的E1激活酶和E2连接酶与泛素（终浓度 1uM）和E6AP（终浓度 16nM）加入到96孔板中，之后加入ATP（终浓度为0.2 mM）后构成反应体系（50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM MgCl2和1 mMβ-巯基乙醇）以开始E3自动泛素化。测定Ube1饱和信号时，UbcH5c浓度设定为100 nM；测定E2亲和力时，Ube1浓度设定为5 nM。室温孵育1h后，PBST洗3遍。多聚泛素的检测方法如上所述。米氏方程适用于相对速率(RLU/min)测定，利用Prism软件(GraphPad, San Diego, CA)得出表观Km值。由于这套试验不能得出绝对速率，因此通过该试验平台不能得到Vmax。

高通量筛选试验

任何高多样性的小分子库都将是兼容的。10mM的测试化合物用100%DMSO稀释到2.5mM。然后，通过上述方法预包被UBA2及预封闭96孔板。随后，取0.5ul 2.5uM测试化合物至25ul反应体系中(测试化合物终浓度为50uM)孵育30min，反应体系中其他组成成分终浓度分别为：10 nM Ube1, 200 nM UbcH5c, 16 nM of CARP2，50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM MgCl2和1 mMβ-巯基乙醇。加入含1.1uM泛素和0.4uM ATP的25 ul含50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM MgCl2和1 mM β-巯基乙醇的反应液后，自动泛素化开始。20min后，如上所述通过洗板终止反应，泛素化产物通过上述方法检测。每个检测板设置内对照，使用终浓度为10uM的NEM和1%的DMSO依次作为100%和0%抑制。百分抑制率通过公式：[1 – ((RLUCompoundl – RLUNEM)/(RLUDMSO – RLUNEM))]*100计算出来，测试化合物的平均百分抑制率为14.9 ％，标准偏差为11.3％。与平均百分抑制率相比，抑制CARP2自动泛素化超过四倍标准偏差的化合物为有效化合物，并通过上述方法重新筛选加以验证。

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