抗体表位绘图

简要过程：

抗原编码基因的PCR扩增和超声分散。端点通过接合作用被克隆和修复，然后重组到大肠杆菌中的谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合表达载体。转化大肠杆菌菌株库，并且用QPix2XT (Genetix)挑选菌落。培养一段时间后，细菌在22.2 × 22.2cm的硝酸纤维素薄膜上形成菌斑。一个标准的点印迹，用于在Typhoon™扫描器下进行荧光检测。细胞有一个积极地（这里的一个亮点）用于质粒制备和测序的点。衍生的序列有一致的抗原决定簇。最小重叠序列分别克隆并且受到抗原决定簇验证。

人高多样性VDR肽库的产生:
对于库的构建，就像材料和方法上所描述的那样，PCR扩增全长VDR的开放阅读框，超声波分散，并克隆到表达载体用于大肠杆菌中重组蛋白的生产。大约有1 × 106个独立克隆产生，足以成为一个单一的割裂基因库（见下文）。创建库的复杂性估计要连续30个随机选择的克隆。在长度为17至30个氨基酸的大概会插入30%， 30个氨基酸的约50%，30至50个氨基酸的约20%，所有合适的大小均用于抗原表位绘图。测序分析仪也表明克隆效率为90％。根据理论假设，1/6的克隆可以插入正确的框和方向并且有90％的克隆效率，那么至少有150，000个正确插入的克隆框应该存在VDR的片段库。如此多的开放阅读框应完全覆盖重叠插入了人VDR基因。

库的构建:
人VDR基因编码在结合营养衍生配体中起重要作用，它是一个核受体家族成员的转录因子，能施加影响促进骨矿物质平衡。PBD-GATE2载体克隆人全长VDR核酸序列，通过基因特异引物扩增（正向：5′-ATGGAGGCAATGGCGGCCAGCA-3′; 反向：5′- AGGAGATCTCATTGCCAAACA-3′）。用Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System（(Promega, Madison, WI)）根据试剂盒的说明纯化1.2Kb的PCR产物，然后超声分散。超声波处理的DNA琼脂糖凝胶电泳分离显示片段下降到100bp。将100-300bp的片段再纯化并用End-It™ DNA End-Repair Kit（Epicentre, Madison, WI）处理平末端。为了获得操作的灵活性，我们将片段克隆到设计用于特异位点重组克隆的载体(in-house-created Entry vector)。为了达到这一目的，载体pDONR™/ ZEO(Invitrogen, Carlsbad, CA)配备了一个平末端克隆的酶切位点。接合pDONR™/Zeo and attL × attR-directed后，重组到细菌表达载体pDEST™15 (Invitrogen)，获得个1 × 106单克隆。

蛋白质阵列，菌落斑和重组蛋白表达的建立：
库中的pDEST™15用于转化大肠杆菌BL21 Star™(DE3)中的感受态细胞，细胞接种到含有氨苄青霉素(100 µg/mL)的LB培养基中。共有2304个菌落被QPix2XT robot (Genetix, New Milton, Hampshire, UK)挑选到384微孔板含补充氨苄青霉素(100 µg/mL)的液体LB培养基中。培养一段时间后，培养菌在0.45µm孔径的PROTRAN™硝酸纤维转化膜(Whatman GmbH, Dassel, Germany)上形成菌斑。细胞生长在37 °C，在这种覆盖固体LB培养基的膜上过夜。通过转膜到辅以氨苄青霉素和异丙基-β-D-1-半乳糖苷(IPTG; 0.5 mM)的固体LB培养基上诱导蛋白表达且在37℃下孵育三小时。

抗原表位的筛选和检测：
将这些膜上的细胞转移到含有0.02％Tween-20与3％的的印迹高档奶粉(Carl-Roth GmbH, Karlsruhe, Germany)的PBS中进行细胞溶解，这些释放的重组蛋白约束在硝化纤维上。为了检测，所用的是改善的点印记工艺，这是扩大到容纳22.2×22.2平方厘米大的膜，且荧光标记二抗并在Amersham Typhoon™ Scanner (Amersham, Pittsburgh, PA)上进行荧光扫描。起初用的抗体是市售鼠标单克隆IgG2A的抗人类VDR抗体(sc-13133; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)。为了便于，用到的是Alexa Fluor® 488标记的羊抗鼠IgG抗体(Invitrogen)。用Amersham Typhoon™扫描仪检测代表阳性抗体结合的点阵列。在532nm处激发，用526nm的滤光器测量辐射。只有那些在背景下发出至少100％的荧光信号的点才被视为命中和易于DNA测序。我们通过计算平均10个随机选取的非荧光点来定义背景。

DNA测序和分析：
细菌培养的在蛋白阵列上代表阳性点的细胞易于发生质粒脱离。载体特异引物(5′-GGCAAGCCACGTTTGGTG-3′)在ABI 3130 Genetic Analyzer Capillary Array (Applied Biosystems, Foster City, CA)上标准的双脱氧测序。检查并校正产生的序列。最小重复序列用于进一步的验证。

Western杂交和免疫荧光：
DNA序列编码由Gateway®兼容的通过第一个特异的，然后辅以适配引物再克隆到pDONR™/Zeo (Invitrogen)里制造的37个氨基酸抗原决定簇。经过attL×ATTR重组，最小的序列穿梭到pDEST™15（Invitrogen）。首先，用pDEST™15抗原决定簇构象转化大肠杆菌BL21 Star™ (DE3) cells (Invitrogen),并用0.5 mM IPTG在指数增长阶段处理2小时诱导重组蛋白表达。用MagneGST™蛋白纯化系统(Promega)根据配套协议纯化重组蛋白。Western杂交操作步骤，纯化后的蛋白和天然裂解液用于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。使用相同的抗VDR抗体。酸性磷酸酶连接的羊IgA抗鼠抗体(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)被用作辅助检测抗体。在内部创建的一个有终止密码子的pDEST™15载体被用来作为裂解的阴性对照，来自细胞全长VDR pDEST™15表达的细胞裂解被用作阳性对照。作为一个验证步骤，纯化的抗原表位致使抗VDR单克隆抗体抗原表位结合位点饱和，作为一个对照组，等量的非敲除抗VDR单克隆抗体被用到。在ph7.4时用PBS洗涤密集的6微米人皮肤组织冰冻切片，用4％的甲醛在PBS中固定10min，用0.25% Triton X-100 (AppliChem, Darmstadt, Germany)在PBS中渗透5min，最后用3倍的PBS洗涤5min。用敲除和非敲除的抗VDR单克隆抗体分别在4℃下做过夜处理，对皮肤切片进行探索。陆续在PBS洗涤5min后，Alexa Fluor® 594标记的羊抗鼠IgG (Invitrogen)被用来作为在4℃下1小时潜伏期的辅助检测抗体。在PBS洗5min后，这些切片用4′,6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI; dilution 1:2000 in PBS; Sigma-Aldrich)作最终处理并且用Zeiss Axioskop MC100 (Carl-Zeiss Micro Imaging, Göttingen, Germany)检测。

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