药物新靶点和基于384孔板高通量筛选的最佳实验方案

第一部分 基于shRNA的方法

质粒构建
构建报告基因质粒：luciferase（pGL3; Promega, Madison, WI, or Genbank U47295） 基因克隆到pLLB3-GW-Kan慢病毒载体，限制酶切位点为Xba1 和Nhe1。新的序列确认无误的命名为pLLB3-GW-KanpGL3。
病毒包装
1、HEK293T细胞以7.8×105数量重悬于2ml无抗生素含10% FBS 接种至六孔板（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, or Fisher,Pittsburgh, PA），放置于37° C, 5% CO2培养箱，培养过夜。
2、取1.5ml灭菌EP管，加入1.5μg包装混合质粒和0.3μg表达质粒以及282μl的无血清培养基，18 ul Fugene 6 (Roche, Basel, Switzerland)轻柔混匀，室温孵育30min。
3、将DNA溶液和转染试剂加入铺板的293细胞中，37° C, 5% CO2培养，过夜。
4、移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除，代之以含10%FBS和1%青霉素-链霉素DMEM培基。培养过夜。
5、收集转染后48h的细胞上清，更换为完全培基。
6、转染后72h，收集细胞上清，与48h收集的上清混合。
7、用0.45um的聚二氟乙烯过滤器（(Millipore, Billerica, MA)）去除含病毒上清中的非贴壁细胞，分装，冻存于-80°冰箱。

病毒转导
1、 SKOV3、A549、Hela、MDA-MB-231或Panc 4.03 细胞以 200,000/孔接种于六孔板。
2、24h后，用1.5ml 含8 ug/ml 聚凝胺(Sigma, St. Louis, MO)和10 mM HEPES (Gibco, Carlsbad,CA)的完全培基更换。加入190ul的含病毒上清，以2100 rpm (1000g)速度轻轻摇动细胞1.5h。
注意：病毒转导的最适条件在不同的细胞系之间有差异。但由于luciferase报告基因的高表达，此步优化不是特别关键。在siRNA转染前至少孵育3h（标准的是与病毒共孵育24h，但转染前孵育3h即可）。
第二部分 基于siRNA 的方法

siRNA转染
1、在384-well组织培养皿中将每份lipid反应物与4ul的Opti-MEM-I混合。
2、在4ul Opti-MEM-I中加入206 nM siRNA，并与lipid反应物混合,孵育30min。
（该体系中siRNA浓度为25nM，如果siRNA浓度需要调整，可以进行稀释。）
3、用磷酸盐缓冲液冲洗luciferase-transduced细胞2次，胰酶消化，细胞计数，种入384孔板中。
4、For a forward transfection, 将混合物加入25ul完全培基培养了24h的细胞中。
5、For a reverse transfection，将25ul细胞加入使用lipid自动分散装置且包含有siRNA的混合培养物中，孵育72h。
注意：每个细胞系根据经验检测分析每个孔中2个细胞之间的密度。检测luciferase活性使用Bright-Glo regent (Promega)，检测细胞存活能力使用Cell Titer Glo cell viability (Promega)。所有的实验数据必需经过三次独立重复实验，结果的平均值与标准偏差必须反映在图表上。

Control siRNA stocks：材料及订购信息

A、Diluted Dharmacon stock siRNAs (GFP) (cat# P-002102-01-05)

靶序列(GFP) 5′-GCG ACG TAA ACG GCC ACA AGT TC-3′

B 、Dharmacon luciferase(pGL3)siRNAs

高度沉默子（cat# D-002050-01-05)靶序列5′-GAT TAT GTC CGG TTA TGT ATT-3′，

中间沉默子(cat# D-002050-02-20)靶序列5′-CTG AAT ACA AAT CAC AGA ATT-3′,

低沉默子   (cat# D-002050-03-20)靶序列5′-TCC GGA AGC GAC CAA CGC CTT-3′。

C、甘油醛三磷酸脱氢酶(GAPDH)(cat# MQ-004253-01)

D、甲羟戊酸（二磷酸）脱羧酶(MVD) (cat# MQ-006748-00)

E、磷脂酰肌醇-4-激酶催化多肽 (PIK4CB) (cat# MQ-006777-02)

F、pGL2 luciferase (cat# D-001100-01-05)

进行QPCR的siRNAs实验包括caspase-8 (cat# M-003466-04)和MKSTYX (cat# M-008031-01)，Dharmacon SMART pools 和TNFRSF1A (cat# MQ-005197-00),而 YARS (cat# MQ-011498-00)以及 TRIB3 (cat# MQ-003754-01) 则作为独立的Dharmacon siRNAs。

第三部分  质量控制

实时荧光定量PCR

1、两孔分别转染siRNA之后，用RNeasy96试剂盒(Qiagen, Venlo, the Netherlands)抽提mRNA。

2、DNAse 1预处理两次，每次15分钟。

3、用High Capacity cDNA Archive试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA)合成cDNA，其中引物为oligo dT25 (Sigma Genosys)、缓冲液中含有MgCl₂ (Ambion, Foster City,CA)。

cDNA合成体系

4、在Applied Biosystems 7900HT系统上，以SYBR® Green为染料，扩增下列引物（Sigma），定量检测cDNA

① caspase-8 (NM_001228)

②MKSTYX (NM_016086)

③TNFRSF1A (NM_001065)

④YARS (NM_003680)

⑤TRIB3 (NM_021158)

不同细胞系的推荐接种密度（针对细胞生长分析）

表1 、384孔板每孔接种细胞密度（低/高）

表2、 384孔板转染条件优化

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