第一部分 基于shRNA的方法
质粒构建
构建报告基因质粒:luciferase(pGL3; Promega, Madison, WI, or Genbank U47295) 基因克隆到pLLB3-GW-Kan慢病毒载体,限制酶切位点为Xba1 和Nhe1。新的序列确认无误的命名为pLLB3-GW-KanpGL3。
病毒包装
1、HEK293T细胞以7.8×105数量重悬于2ml无抗生素含10% FBS 接种至六孔板(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, or Fisher,Pittsburgh, PA),放置于37° C, 5% CO2培养箱,培养过夜。
2、取1.5ml灭菌EP管,加入1.5μg包装混合质粒和0.3μg表达质粒以及282μl的无血清培养基,18 ul Fugene 6 (Roche, Basel, Switzerland)轻柔混匀,室温孵育30min。
3、将DNA溶液和转染试剂加入铺板的293细胞中,37° C, 5% CO2培养,过夜。
4、移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除,代之以含10%FBS和1%青霉素-链霉素DMEM培基。培养过夜。
5、收集转染后48h的细胞上清,更换为完全培基。
6、转染后72h,收集细胞上清,与48h收集的上清混合。
7、用0.45um的聚二氟乙烯过滤器((Millipore, Billerica, MA))去除含病毒上清中的非贴壁细胞,分装,冻存于-80°冰箱。
病毒转导
1、 SKOV3、A549、Hela、MDA-MB-231或Panc 4.03 细胞以 200,000/孔接种于六孔板。
2、24h后,用1.5ml 含8 ug/ml 聚凝胺(Sigma, St. Louis, MO)和10 mM HEPES (Gibco, Carlsbad,CA)的完全培基更换。加入190ul的含病毒上清,以2100 rpm (1000g)速度轻轻摇动细胞1.5h。
注意:病毒转导的最适条件在不同的细胞系之间有差异。但由于luciferase报告基因的高表达,此步优化不是特别关键。在siRNA转染前至少孵育3h(标准的是与病毒共孵育24h,但转染前孵育3h即可)。
第二部分 基于siRNA 的方法
siRNA转染
1、在384-well组织培养皿中将每份lipid反应物与4ul的Opti-MEM-I混合。
2、在4ul Opti-MEM-I中加入206 nM siRNA,并与lipid反应物混合,孵育30min。
(该体系中siRNA浓度为25nM,如果siRNA浓度需要调整,可以进行稀释。)
3、用磷酸盐缓冲液冲洗luciferase-transduced细胞2次,胰酶消化,细胞计数,种入384孔板中。
4、For a forward transfection, 将混合物加入25ul完全培基培养了24h的细胞中。
5、For a reverse transfection,将25ul细胞加入使用lipid自动分散装置且包含有siRNA的混合培养物中,孵育72h。
注意:每个细胞系根据经验检测分析每个孔中2个细胞之间的密度。检测luciferase活性使用Bright-Glo regent (Promega),检测细胞存活能力使用Cell Titer Glo cell viability (Promega)。所有的实验数据必需经过三次独立重复实验,结果的平均值与标准偏差必须反映在图表上。
Control siRNA stocks:材料及订购信息
A、Diluted Dharmacon stock siRNAs (GFP) (cat# P-002102-01-05)
靶序列(GFP) 5′-GCG ACG TAA ACG GCC ACA AGT TC-3′
B 、Dharmacon luciferase(pGL3)siRNAs
高度沉默子(cat# D-002050-01-05)靶序列5′-GAT TAT GTC CGG TTA TGT ATT-3′,
中间沉默子(cat# D-002050-02-20)靶序列5′-CTG AAT ACA AAT CAC AGA ATT-3′,
低沉默子 (cat# D-002050-03-20)靶序列5′-TCC GGA AGC GAC CAA CGC CTT-3′。
C、甘油醛三磷酸脱氢酶(GAPDH)(cat# MQ-004253-01)
D、甲羟戊酸(二磷酸)脱羧酶(MVD) (cat# MQ-006748-00)
E、磷脂酰肌醇-4-激酶催化多肽 (PIK4CB) (cat# MQ-006777-02)
F、pGL2 luciferase (cat# D-001100-01-05)
进行QPCR的siRNAs实验包括caspase-8 (cat# M-003466-04)和MKSTYX (cat# M-008031-01),Dharmacon SMART pools 和TNFRSF1A (cat# MQ-005197-00),而 YARS (cat# MQ-011498-00)以及 TRIB3 (cat# MQ-003754-01) 则作为独立的Dharmacon siRNAs。
第三部分 质量控制
实时荧光定量PCR
1、两孔分别转染siRNA之后,用RNeasy96试剂盒(Qiagen, Venlo, the Netherlands)抽提mRNA。
2、DNAse 1预处理两次,每次15分钟。
3、用High Capacity cDNA Archive试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA)合成cDNA,其中引物为oligo dT25 (Sigma Genosys)、缓冲液中含有MgCl2 (Ambion, Foster City,CA)。
cDNA合成体系
成分 | 体积 ul |
10x缓冲液 | 10 |
1 M MgCl2 | 0.55 |
100 mM dNTPs | 4 |
20 U/ul RNasIn | 1 |
50 U/ul Multiscribe | 5 |
双蒸水 | 12.45 |
RNA | 67 |
合计:100 |
4、在Applied Biosystems 7900HT系统上,以SYBR® Green为染料,扩增下列引物(Sigma),定量检测cDNA
① caspase-8 (NM_001228)
GGTCACTTGAACCTTGGGAA | GAACTTGAGGGAGGCCAGAT |
碱基:203到328,跨越229位32347 bp的内含子 |
②MKSTYX (NM_016086)
ACATCCTGAAAGGGGGCTAT | GCACGATTTCAATGGGGTAT |
碱基:716到836,跨越795位8333 bp的内含子 |
③TNFRSF1A (NM_001065)
GCTTCAGAAAACCACCTCAGACA | ATGCCGGTACTGGTTCTTCCT |
碱基:551到662 |
④YARS (NM_003680)
GCCCTGAAGAGAAACTGCAC | GGGCACAAAGTAAGCCACAT |
碱基:804到953,跨越845位6128 bp的内含子 |
⑤TRIB3 (NM_021158)
TCAAGCTGTGTCGCTTTGTC | CTTGTCCCACAGGGAATCAT |
碱基:1053到1163,跨越1090位4616 bp的内含子 |
不同细胞系的推荐接种密度(针对细胞生长分析)
表1 、384孔板每孔接种细胞密度(低/高)
表2、 384孔板转染条件优化
细胞系 384孔 |
Hela 750/1500 |
Hek293 2500/5000 |
SKOV3 750/1500 |
A549 750/1500 |
HCT116 1000/2000 |
Huh7 1000/2000 |
A673 2500/5000 |
XMD5 750/1500 |
UMR 750/1500 |
MDA-MB-231 750/1500 |
Panc 4.03 750/1500 |
细胞系 细胞数/孔 转染试剂 试剂体积/孔 |
Hela 750/1500 Dharmafect4 0.07 |
Hek293 2500/5000 Dharmafect4 0.07 |
SKOV3 750/1500 Dharmafect2 0.03 |
A549 750/1500 Dharmafect1 0.07 |
HCT116 1000/2000 Dharmafect3 0.07 |
Huh7 1000/2000 Lipofectamine2000 0.03 |
A673 2500/5000 Dharmafect3 0.03 |
XMD5 750/1500 Dharmafect1 0.07 |
UMR 750/1500 Dharmafect1 0.03 |
MDA-MB-231 750/1500 Dharmafect4 0.03 |
美中药源原创文章,转载注明出处并添加超链接,商业用途需经书面授权。
★ 请关注《美中药源》微信公众号 ★