人类长链脂肪酸转运蛋白4 和5的高通量筛选试验的发展和验证

应用: 代谢性疾病

理由: 食物中的长链脂肪酸的跨细胞膜的吸收主要由脂肪酸转运蛋白(FATP)传递. 在人类和rodent动物体内这种转运蛋白有6个不同表达的亚型存在.为了方便对抗FATP亚型的药物的开发, 这个实验采用哺乳动物细胞系稳定表达重组人类FATP 4 和5,并开发一种使用一个96孔荧光成像板阅读仪(FLIPR)的高通量筛选(HTS)的检测. LCFA吸收的信号对背景之比是在3-5倍之间. 两种化合物产生对FATP 4的抑制, 其1/2最大抑制浓度(IC50)分别是0.21和0.63 uM, 并显示选择性超过FATP5约100倍. 从美国药物收集库筛选对抗FATP 5 的药物观察到约0.4% 的命中率. 两种被证实的有效物是胆汁酸,其IC50 分别是2.4 和0.22 uM. 为增加产量,用分析HT发展了一种在一个384孔形式中的单一时间测定的方法, 其结果可与96孔板方式相比. 总之,基于细胞的FATP 4 和5 的荧光检测适合于一个主要的药物筛选, 而分化的细胞系可用于辅助药物的筛选.

方法:
. Hs FATP 4 和5稳定表达的细胞株和试剂:
人类胚胎肾(HEK)293 细胞株的建立能稳定表达人类重组HsFATP1,4,和5已在以前描述过. 4种细胞培养基和补充物购自Gibco Invitrogen (Invitrogen, CarIsbad, CA); QBT 脂肪酸检测盒从MDS 分析技术(原Molecular Device Co, Sunyvale, CA)购得; 鹅去氧胆酸, 油酸,棕捛油都购自Sigma-Aldrich(St.Louis, MO). 两种FATP4抑制剂, j3 和 j5, 都是根据最进发表的文章而合成. 美国药物收集库(USDC)由已知药理的1040种化合物组成, 29 种化合物购于Microsouce (Gaylordsville, CT). 所有的化合物都溶解在浓度为10mM的二甲基亚砜中作为储备溶液.
细胞培养: hsFATP1, 4,或5的细胞及载体控制的HEK293细胞被接种于含有2250毫克/升D-葡萄糖, 维生素B6, 0.5 CaCl2, 辅以10% 胎牛血清(FBS)和100个单位的青霉素-100微克链霉素/毫升及加有1毫克/毫升G418 (基因选择)的Dulbecco”s 改良Eagle’s培养基(DMEM).细胞接种到有PDL涂层的,黑色壁,透明底部的微孔板(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). 当细胞密度达到80,000/孔时用96孔板方法, 或者在20,000/孔时用384孔板方式. 在接种后12-16 小时,平板可用于测定.
3T3-L1 前脂肪细胞,(美国型培养物收集, 货号CCL92-1), 按照发表的文章的方法分化细胞. 24,25细胞分化的测定通过在显微镜下目视脂滴的积累. 在进行检测之前12-16小时,当细胞密度达到100,000/孔时接种到96孔平板.

QBT kit和荧光强度测量
QBT混合物按夹在产品中的指示(R8133,MDS Analytical Technologies)进行准备并包括专有的抑制剂和2uM荧光标记的脂肪酸肾上腺素-FA。细胞防渗抑制剂有效抑制在溶液中肾上腺素-FA荧光。细胞吸收了肾上腺素-FA，细胞内的荧光测定采用自下而上阅读探测器FLIPR或分析师HT（两种都来自MDS分析技术）。所有合成的小分子溶解在DMSO作为储备溶液，然后稀释用1×充填缓冲液（1×汉克氏平衡盐溶液加有20mM的HEPES缓冲液和0.2％无脂肪酸牛血清白蛋白[BSA]）。在96孔板方式中做动力测定, 平板中的培养基用150微升1×充填缓冲液加50微升稀释的浓度在5×的化合物（或175微升1×充填缓冲液加25微升稀释的浓度在10×的化合物）在37°C在5％二氧化碳培养箱培养30分钟。在培养结束时，加入50微升的QBT混合物到培养孔. 为检查脂肪酸衍生物的抑制效应，我们把培养的混合物溶解在乙醇里作为储备溶液, 然后用1×充填缓冲液稀释。在4C下. 在添加到培养平板做吸收测定之前,这个稀释物用QBT混合物进行平衡24小时。在把QBT混合物加入到细胞后，立即用FLIPR进行荧光读数. 室温下FLIPR的激发过滤器波长λex=488纳米,而排放过滤器的发射波长= 540 nm。在384孔的格式中, 用单一时间点检测的方法, 培养基要换成35微升1×充填缓冲液加5微升10×浓度的稀释化合物
在5％CO2培养箱在37℃培养30分钟. 在培养结束时,10微升QBT混合物添加到培养孔. 然后, 随着染料的培养, 在1分钟,1小时,每孔的荧光密度用分析师 HT进行测量, 在室温下其发射过滤器波长λex=488纳米，排放过滤器的波长=540纳米。以双盲的方式进行先导药物筛选.有效者仍用密码直到完成浓度反应试验的证实再解码.
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数据分析:

动力学分析，用FLIPR连续观察吸收肾上腺素-FA 1小时. 每孔的相对荧光
单位（RFU）的水平通过减去在第一数据点的荧光水平. 在1小时的观察后终端点的相对荧光单位(RFU)，作为最大的脂肪酸摄取量.在384孔格式的单一时间点检测, 每孔的绝对荧光强度作为最大的脂肪酸摄取量. 在主要的检测方法开发中荧光信号的百分比变化（抑制或增强）与实验对照组比较按照双重测量的平均值计算.。因为我们无法测定培养孔中最后的游离脂肪酸浓度，抑制脂肪酸的效力是基于起始浓度的假设,即在生长介质中脂肪酸结合类似程度的的蛋白质。同样，小分子的药效是根据他们所表现的摩尔浓度而估计，因为我们没有确定其蛋白结合全貌。浓度反应曲线建造,并能适合一个4个参数的S 型函数以产生最大半抑制浓度（IC50）。适当的情况下，数据代表平均值}SEM至少3 次测量。

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