建立稳定生产表达IGF-1R细胞株以供筛选抗IGF-1R单克隆抗体（mAB）或小分子酪氨酸激酶抑制剂所用

该方法也适用于其它类型的致癌酪氨酸激酶(RTKS)受体

建立一个能诱导表达IGF-1R的 MEF细胞系株
克隆编码IGF-1RcDNA 并在C-末端加2 myc6His标签,插入pTRE载体(Clontech 公司), 通过共转染质粒pSV Hygro 进入tet-off MEF细胞株而建成. 用 200微克/毫升潮霉素（hygromycin）选择被成功转染的细胞.

用荧光激活细胞分选/Western/磷酸化酶联免疫吸附试验分析鉴定细胞株
用荧光激活细胞分选(FACS)/WESTERN/磷酸化的酶联免疫吸附试验(ELISA)测定时, 将细胞置于有或无强力霉素的状况下超过48小时, 然后以每孔750,000个细胞的浓度接种于6个10 cm的培养皿里, 并继续在有或无强力霉素的培养基中培养。接种后24小时, 5 个培养皿用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次、然后把培养液换成含有0.1%FCS的DMEM。 再过第24小时后加入0, 5, 50, 100, 和 200 ng IGF-（13769，Sigma, Hamburg, 德国），这些细胞继续培养24小时。 次日, 去掉培养皿的上清液、用PBS 洗一次，把用胰酶消化的细胞与上清液混合在一起. 用离心的方法收集细胞并重新悬浮于500毫升PBS。取其中 250微升的细胞悬液、用甲醛固定, 用含有100微克/毫升核糖核酸酶H和25微克/毫升的碘染色PBS染色, 然后用FACSCalibur(流式细胞, 迪肯森,德国海德堡)进行分析. 剩余的细胞离心沉淀，用缓冲液A(20 mM TRIS pH8/135mM NaCl/1%NP-40/10%甘油/1.5mM层酸钠)外加一片整套蛋白酶抑制剂(Roche, 德国曼海门)的溶液裂解。 蛋白质含量测定采用Bradford 方法. 裂解液用ELISA和Western blot方法分析。ELISA 分析: 100微克蛋白质加到预涂有抗-myc(9E10)抗体的96孔板. Py-99抗体被用来检测磷酸化的IGF-1R。Western-blot: 300 微克蛋白质涂抹到硝酸纤维素膜用抗-myc(9E10),、抗-IGF-1R,、抗-AKT1 和磷酸-AKT 抗体(全是1:200)检测。

软琼脂和免疫荧光检测细胞：
把细胞先培养在加有或无强力霉素的培基中至少48小时后，细胞才能进行软琼脂以及IGF-1R免疫荧光检测。
软琼脂检测:
细胞被包埋在含有DMEMFCS 4%琼脂糖里, 并保持原来加或不加强力霉素的状态、接种到涂有0.8%琼脂糖培养皿上.
免疫荧光分析:
细胞被放在盖玻片下, 用4%多聚甲醛固定并使细胞通、 再用9E10抗体为第一抗体及用FITC标记的抗鼠抗体为第二抗体进行检测、 随后用DAPI复染细胞核。

细胞磷酸化检测:
细胞先在有或无强力霉素培基中至少培养48小时,然后被接种到48孔板里。 在无血清饥饿18小时后, 加入经二甲基亚砜连续稀释后的化合物 (二甲基亚砜的最终浓度为1%)，培养90分钟、随后加入IGF-1作用10分钟。 然后，细胞被裂解,如同以上描述的进行ELISA检测。 显示出最有力抑制IGF-1R磷酸化及其下游效应物AKT磷酸化的化合物，将被选为最有前景的先导化合物。

体内移植瘤活性的研究:
用29G针头的注射器注射，在左侧腹背部的皮下组织里注射0.2毫升含有4X107细胞。原发肿瘤的体积用肉眼检查, 通过游离卡尺测量大小并乘以所有立体面的距离. 当原发肿瘤的体积达到约200立方厘米后, 开始用化合物/抗体治疗或用强力霉素 (在含有1%蔗糖的饮用水里放2毫克/毫升)。在研究过程中, 动物的体重每周称三次、每天监测动物的行为。 评价IGF-1R抗体抗肿瘤的活性的标准是肿瘤的消退.
完全消退(CR)—肿瘤消退到小于触诊的最低限度(<63毫米)
部分消退(PR)—肿瘤缩小超过50%(CR包括在PR内)
对于尿嘧啶标记的部分,剖检前24小时,往动物的腹腔内注射100-200微升含有10微克/毫升尿嘧啶的无菌1XDPBS (BD Pharmingen).

在MEF/IGF-1R 肿瘤样本里IGF-1R蛋白质的表达:
把肿瘤切成小块,在Qiagen研磨混合器MM301里, 混与冰冷的溶解缓冲剂(1%Triton-X-100, 100mMNaCl, 10mMtris-HCl（pH7.5）, 1mMEDTA(pH8), 1mMEGTA(pH8), 1mMNaF, 20mMNa4P2O7, 1mMNa3VO4, 10%甘油,以及一片蛋白酶抑制剂. Roche 诊断, 曼海门,德国)。在4C进行2小时培养后, 肿瘤裂解物在4C下以16000g离心15 分钟. 把上清液吸到一个放在冰浴里的新的干净的管子里. 按照制造商的指示, 用Bradford进行总蛋白浓度的测定(BIO-RAD protein Assay). 这些肿瘤裂解物要储存在-80C直到进行测定. 在肿瘤裂解物里, IGF-1R表达及AKT磷酸化可使用市售的酶联免疫吸附试验合, 按照厂商的说明进行测定(Dy391;R&DSystems, LilleCEDEX, 法国).

免疫组化:
从单个冰冷肿瘤里准备7微米冰冻切片, 并用4%甲醛固定.用酒精加3%H2O2固定内源性的过氧化物酶. 外源性的和总的IGF-1R则用生物素酰化的9E10抗体及随后的链霉亲和素和辣根过氧化物酶(PO)接合的抗兔抗体进行测定. TUNEL 和Brad U的染色则根据厂商的说明进行(分别是 Roche, 及 BD Pharmingen).

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