使用非洲蟾蜍提取物筛选Wnt-B-catenin 的信号通路的小分子抑制剂

基本原理和流程图:

Wnt 信号通路的异常活化已被证明是与多种人类疾病,最明显的是癌症, 相关联的. 这一通路的抑制剂的筛选几乎完全使用培养的哺乳动物细胞. 众所周知, 这可能会有人为的倾向及由于所用细胞株的基因背景而导致结果偏颇. 现在我们使用融合B-连环素和Axin 与萤火虫及海肾荧光素酶, 实验分别表明融合的蛋白质的表现类似于它们的野生型配对物. 使用这钟双荧光素酶的读数, 我们改用非洲蟾蜍提取物系统来进行高通量筛选. 从这些结果表明信号分布曲线反应出抗体库筛选的复杂性. 凭借这些结果, 我们可以合理推测其它胚胎途径, 癌症的失控.及用非洲蟾蜍卵提取物改变筛选抑制物/调制物.
附加工具: 以非洲蟾蜍为基础的筛选能作为一种独立的佐证工具来验证从哺乳动物的筛选, 并获得额外的信心.

方法:
化合物和重组蛋白
试剂– 3,6-二羟基,5,7-二羟黄酮, 儿茶素水合物, 放线菌酮均购自Sigma-Aldrich(圣路易斯, 密苏里州). LRP6-ICD 象以前描述的那样准备,但有轻微的改变. 8 种细菌的沉淀物用6M盐酸胍变性, 组氨酸标记的LRP6-ICD 与镍树脂结合,然后用咪唑洗脱. 洗脱用透析方法去掉盐酸胍. 所有的化学结构用CS ChemDraw Ultra 的方法提取. 除非另有说明, 二甲基亚碸在所有的实验中用作所有化合物的载体.

在体外翻译的蛋白质
按照产商的指示, 放射性标记的B-Catenin 和Axin生成于兔网织细胞裂解液(Promega 公司, 麦迪孫, 威斯康星州). 另外用于HTS的B-Catenin-FLuc 和 Axin-RLuc 亦根据产商的指示产生于ＴＮＴ　ＳＰ６高产蛋白表达系统（Promega）．

非洲蟾蜍卵提取物的准备：
所有的蟾蜍都在排卵前３－７天用１００U　孕马血清促性腺激素激活（孕马血清，Sigma公司）．　给予５００Ｕ人类绒毛膜促性腺激素诱导排卵．然后，每一只蟾蜍放在一个装有约２升的Marc’s 改良林格氏液(MMR)（１００mＭNaCl, 2mM KCl, 1mMMgCl2, 2mMCaCl2, 0.1mMEDTA, 5mMHEPES(pH7.8).的大箱内，并让其在１６Ｃ条件下排卵１２－１８小时，　再把蟾蜍移至另外的容器．把蟾蜍卵集中到一个烧杯内，用１６Ｃ的１ＸＭＭＲ液体洗三次以去除碎片．让蛙卵沉淀，去除多余的缓冲液．然后温柔旋转，使蛙卵重新悬浮在一个含有２％半胱氨酸的ＭＭＲ液体里．胶样外膜约５分钟内开始溶解，并且当蛙卵完全沉淀在一起时完全溶解．用大量的１ＸＭＭＲ清洗蛙卵，直到缓冲液看上去不再混浊．蛙卵然后再用蟾蜍缓冲液（１０0 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM potassium HEPES(pH7.7),50 mM Sucrose）洗两次．用大口塑料巴斯德吸量器把看上去是白色的蛙卵吸去因为这些细胞已死亡并可能汚染提取物．把蛙卵移到一个冷却的３０毫升离心管．当卵子一沉淀就吸去多余的缓冲液．把这些蛙卵首先在ＳorvalRC-6里４度下用２００rpm离心２分钟以进一步去除多余的缓冲液，４度下再用２１，０００g　粉碎性离心５分钟以使提取物分离成三个主要层次．中间层含有细胞质．用一个p1000的塑料吸管头通过在顶部脂质层打一个孔把这一层吸出再放进一个新鲜的，冷却的３０毫升的管子，加入细胞松弛素Ｂ（１０微克／毫升）以防止肌动蛋白的聚合．提取物用２１，０００g离心，细胞质被转移两次．最终的提取物应该是淡黄色．蛋白酶抑制剂（１０００Ｘ贮存浓度，亮肽素，靡酶抑素，和胃蛋白酶抑制剂都是１０毫克／毫升于ＤＭＳＯ内）．能原组合（２０mM三磷酸腺苷, 150 mM 磷酸肌酸 2 mM EGTA, 20 mM 含水MgCl2 (pH7.7)）都被加入并混合，提取物被分装，快速冷冻，储藏在液氮里．这种提取物能保存B-Catenin 和Axin的降解活性一年以上．

３８４孔实验条件：
把先前准备的提取物迅速解冻, 并置于冰上. 在体外翻译(IVT)的B-Catenin-FLuc (1 毫升), Axin-RLuc (1.5毫升), LRP6ICD (400 nM) 被加入到100 毫升蛙卵提取物里, 并在4C下以从一端到另一端的转动方式混合10 分钟. 然后样品由一个24 通道的重复吸量器人工地分进冷却的384孔板(5微升/孔)并保持在4C冷藏室内直到需要加其它的化合物. 抗体库化合物用针样工具转移进去(自定义的仪器, 哈佛医学院)或用Echo550隔音板重新摸式化(Labcyte, 范德比尔特化学生物研究所)平板,在 25C 和2%DMSO条件下, 达到最终浓度范围在40到200uM., 然后板子被封好, 轻轻涡旋,在25C培育4小时. 孵化后, 按照生产商提供的方法,用双格洛荧光素酶检测(Promega)萤火虫和海肾荧光素酶活性. 在一个Envision平板阅读仪(PerkinElmer, Waltham, MA)上或FDSS系统(Hamamatsu, Bridgewater, NJ)荧光信号被接受. 当需要稀释时, 蛙卵提取物用蟾蜍缓冲液进行稀释.

筛选统计学:
按照Malo等人的方法要点,我们正常化每一个平板. 在正常化程序中, 使用杜克的中位数去除以删除系统性的行和列的偏差(例如, 边缘效应). 找出Axin 和B-Catenin孔之间的正常化的板块之间的不同(相当于非板块规模的比例).如果在两个复制物中板块的强度差异经验分布在5 - 95%之中,这个化合物就被确定.
如用克鲁斯卡尔-沃利斯分析,数据转化成Z-分数(Z=\frac{x-\mu}{\sigma}), 并用阈值的Z-分数(z <-3, z > 3, 及-3 < z > 3) 来分成三组(活化剂, 抑制剂, 和无活性化合物). 克鲁斯卡尔-沃利斯分析的应用表明: 在这三组中,总数的平均值有着明显的差异(p=1.07e-19).

报告分析:
以细胞为基础的荧光酶检测, HEK293 STF 细胞在次级融合水平被接种到96孔板, 并用稳定格洛荧光素酶检测仪(Progema)进行荧光酶活性测定.使用CellTiter-Glo 检测仪(Promega)使荧光酶活性正常化到活细胞数量. 所有的图表与非线性回归都用Prism4（Graph Pad Software, 圣迭戈,加州）拟合成一个S型剂量反应曲线(可变的曲线).

细胞株:
HEK293 和IEC-6购自ATCC. 用标准的方法生产的一个HEK293 细胞株可在CMV(CMV-Luc)启动因子的控制下稳定的表达萤火虫荧光酶.
细胞株被保存在DMEM及10%胚胎牛血清和抗菌素里.
除非另有说明, 细胞株被用化合物/或Wnt处理24 小时.

抗体和质粒:
用Alpha-B- 连环蛋白(BD 转导实验室, 富兰克林湖, 新泽西)和Alpha – 微管蛋白(圣克鲁斯生物技术, 圣克鲁斯, 加州)抗体进行免疫印迹实验. 以标准的PCR为基本的克隆方法并进一步克隆进pCS2载体产生B-Catenin-FLuc 和Axin-RLuc的融合,LRP6ICD 的细菌表达建立已在 8 描述过.

免疫印迹和免疫荧光:
免疫印迹– 细胞被溶解在非变性缓冲液(50mM Tris-Cl, pH7.4, 300mMNaCl, 5mMEDTA, 1%[w/v]Triton X-100). 可溶性的部份用于免疫印迹.
免疫荧光– 细胞被点在涂有纤维连接蛋白涂层的盖玻片上, 用3,7%的甲醛固定, 染色, 放进备有DAPI的VectaShield (媒介实验室). 用一个装在尼康Eclipse 80i荧光显微镜上的CoolSNAP ES摄像机的60X或100X 的放大物镜来拍摄图像..

非州蟾蜍的研究:
非州蟾蜍在体外受精, 去胶样外膜, 保存和注射如前所述. 化合物溶解在100%DMSO中. 测试复合物沐浴实验: 胚胎被培养在MMR中,化合物按照指定的浓度加入.在第10期, 胚胎用大量的MMR 洗三次,以清除残留的化合物. 按照生产商的说明, 用MESSAGE 机器, 一层层的B-Catenin FLuc 和 AxinRLuc mRNA就生成了.

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