一个强大的高通量筛选胚胎肿瘤细胞的分化和生存的化学调制

应用：癌症（癌症干细胞抑制剂/分化剂）和神经学/组织再生（干细胞生存诱导）

原理：
理清管理干细胞的自我更新，分化或死亡的命运选择的复杂的相互作用，向科研人员提出了一个严峻的挑战。以图像为基础的现象驱动的筛选通过提供快速的多个小分子同时被检测的手段而符合这种挑战。在这种筛选中,多能的胚胎癌（EC）细胞提供了一个方便的胚胎干细胞(ES)替代品，因为它们只需要简单的维护和控制。作者开发了一种基于图像的筛选试验，通过测量细胞数量和细胞表达一个多能性相关的标记SSEA3的比例的效果，以确定能影响人类EC干细胞株NTERA2的生存或分化的化合物. 80个激酶抑制剂的试点筛选确定了几个改善细胞的生存或诱导分化的化合物。这些生存化合物能强烈抑制这些激酶的ROCK和PRK2. 突出了这些激酶在EC细胞的存活中的重要作用。故而猜测这些抑制剂可能在组织再生和神经系统中是重要的工具。两个其他的分子，GF109203X和rottlerin，诱导EC的分化和抑制ES细胞的自我更新能力，导致细胞周期停止，压抑多能性相关基因的表达。这些分子可能是强有力的癌症干细胞抑制体的前体。

方法：

胚胎癌和胚胎干细胞培养
NTERA2 cells3如同以前所述的保存在杜尔贝科的改良Eagle培养基（DMEM培养液; Invitrogen公司，佩斯利，英国），辅以10％小牛血清（FCS;
胎牛血清，ThermoScientific，Cramlington，英国）在37°C及含10%二氧化碳的空气中. 3种人类胚胎干细胞系(ES)被用于这项研究. 它们是shef4，Shef5，Shef6，10和H7.1 所有的ES细胞都被保持以集落形式在不能分裂的小鼠胚胎成纤维细胞上(MEFs). 细胞培养在含有KnockOut
DMEM培养液（KO-DMEM; Invitrogen）, 辅以20％的KnockOut血浆置换（Invitrogen），1mM L-谷氨酰胺（Invitrogen公司），0.1mMβ-巯基乙醇（Sigma-Aldrich公司，普尔，多塞特，英国），1×非必需的氨基酸（Invitrogen公司），和4 ng / mL的基本成纤维细胞生长因子（FGF; Invitrogen公司）, 并置于37℃，含5％的二氧化碳空气中。

化合物:
用于主要筛选的化合物库是蛋白激酶抑制剂库（生物分子，恩佐生命科学，
英国埃克塞特; http://www.biomol.com）。全反式维甲酸和DMSO购自
Sigma-Aldrich公司。

抗体
以下的主要单克隆抗体是从预先滴定的杂交瘤的上清液在自己的实验室制备的:
MC631(anti-SSEA3), 11 MC813-70（anti-SSEA4），12 TRA-1-60，13和
P3X63Ag8.14兔多克隆抗OCT4（ab19857-100; Lot no. 138154）抗体购自Abcam（剑桥，英国）。使用的次要抗体是Dylight-594-结合的山羊抗大白鼠IgM抗体，μ链特异性抗体（112-515-075; Lot no. 82183; Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA）, 荧光素结合的山羊抗小白鼠IgG（115-095-003;批号52637;Jackson ImmunoResearch），或Dylight-488-结合的驴抗兔IgG抗体（711-485-152;Lot no.88371;Jackson, ImmunoResearch）作为适当的主要抗体的亚型.
主要和次要的筛选试验
为筛选化合物，NTERA2细胞接种在96孔μclear平底板,每孔2500
细胞（格雷纳Bio-one，斯通豪斯，英国）。每个化合物进行了三种不同浓度（0.1，1和10μM）的测试，而且是每种浓度一式三份.
井。每个平板中有9个孔含有0.1％DMSO（载体）作为对照，3孔含10微摩尔全反式维甲酸作为分化对照。5天后，细胞用无Ca2 +和Mg2 +的
Dulbecco的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗一次，然后用4％多聚甲醛固定
15分钟。随后是洗涤细胞并在加有10％FCS（封闭液）的PBS中封闭
1小时。细胞然后与主要抗体SSEA3 在一起培养1小时.之后用PBS洗三次，并在一种与FIT C结合的第二抗体中孵育1小时。平板上至少有三个
孔的细胞仅仅与第二抗体在一起培养过.以此确定背景荧光。细胞核用10微克/毫升赫斯特33342（Invitrogen公司）进行复染色。染色细胞的图像
使用自动显微镜平台而获得（InCell分析1000年，GE医疗，小Chalfont
英国）。使用10×目镜从每孔获得10个随机视野。使用开发工具箱1.7软件（GE医疗）对图像进行分析。来于主要筛选中的点击的效果用与主要筛选相同的程序重复试验化合物在0.1，1，2.5，5，10μM的最终浓度进行证实.
Z'因子评估
Z'因子是一个无量纲参数用来评估筛选试验成功与否/.15性能计算Z'因子，
在一个96孔的板中，30孔的细胞经0.1％DMSO处理作为细胞分化的阴性对照..另30孔细胞用10μM的全反式维甲酸处理作为细胞分化的阳性对照。在SSEA3阳性细胞的比例按前面所述进行确定。使用下列公式计算Z'因子
：1 - [（3 * SD（阴性对照）+3 * SD（阳性对照）/（平均值（阴性对照） - 平均值（阳性对照）]。

细胞生长的实验
对于EC和ES细胞生长实验，在rottlerin（0.3-10μM）存在,或有0.1％DMSO载体对照的情况下, NTERA2或Shef4分别以2500或6000个细胞种植于96孔平板的每孔. 经过5天，细胞用PBS洗,并用4％多聚甲醛固定15分钟。用PBS洗涤后，原子核是由10微克/毫升赫斯特33342（Invitrogen公司）染色而可视化和使用InCell Analyzer 1000(GE Healthcare)成像.
克隆形成实验
在涂有基底膜(Matrigel BD公司，牛津大学，英国; KO-DMEM培养液1:25稀释）的6孔板进行检测。 H7型细胞用0.1％DMSO（对照组）或5μM rottlerin进行预处理24小时，然后用胰蛋白酶处理后进行收获.
用培养液洗一次，使细胞重新悬浮在mTESR
培养液（StemCell Sciences，Palo Alto，CA），每孔分别种植10 000个细胞. 经过7天，用4％多聚甲醛固定细胞. 染色用Hoechst 33342（Invitrogen公司）。通过InCell Analyzer1000（GE Healthcare）使平板成像.
使用Developer Toolbox（GE Healthcare）软件从图像进行菌落数计算. 菌落形成效率用7天后菌落的数目和细胞种植的数目的比例来计算.
流式细胞仪检测细胞表面标志
用胰蛋白酶（Invitrogen公司）分离细胞,并重新悬浮在封闭缓冲液（PBS辅以10％胎牛血清）。然后，5×105个细胞与一个主要抗体一起培养30分钟。用封闭液洗涤三次后，细胞用与FITC结合的第二抗体标记30分钟。
随后用封闭缓冲液洗涤细胞三次.,在CyAnADP氧气流式细胞仪（Beckman Coulter公司，布雷亚，CA）上分析细胞荧光。FITC阳性的标准是仅仅和第二抗体一起培养过的对照细胞或与来于母体骨髓瘤细胞系P3X63Ag8的阴性对照抗体一起培养过的细胞

BrdU细胞周期分析
5'-溴-2'-脱氧尿苷（尿嘧啶;Sigma-Aldrich）的结合被用来确定细胞增殖。 shef4细胞用不同浓度的rottlerin或0.1％DMSO（载体控制）处理24小时。然后这些细胞在20μM尿嘧啶中跳动2小时，用PBS洗，之后用胰蛋白酶（Invitrogen公司）处理并收获。 PBS洗涤后，细胞被固定在
70％的乙醇里，并储存在-20°C过夜。用PBS洗涤细胞两次,然后孵育在1.5毫升0.2毫克/毫升胃蛋白酶（Sigma-Aldrich公司）里45分钟。随后细胞用0.1 M的四硼酸钠（Sigma-Aldrich公司）洗两次，用PBS洗一次。细胞用抗BrdU抗体（Dako公司，Glostrup，丹麦）标记45分钟. 之后用PBS洗两次，与FITC标记的山羊抗鼠IgG +M第二抗体（Invitrogen公司）在4C培养45分钟。用加有1％胎牛血清的PBS洗涤3次后,细胞用
20μg/ mL的RNA酶A（Sigma-Aldrich公司）处理30分钟，然后重悬于
在含1％胎牛血清和10μg/ mL的碘化碘（PI; Sigma-Aldrich公司）的PBS里。青色的ADP与氧气光学仪的流式细胞仪（Beckman Coulter）用于分析细胞的荧光。

Annexin V(膜联蛋白质V-FITC) 检测细胞凋亡
shef6细胞生长在六孔板用0.1％DMSO（对照组），或者含有5微摩尔rottlerin，或10微摩尔rottlerin的完全培养液里。每种条件都用一式三份培养孔。在一个18 h的培养后，收获分离的或贴壁的细胞,并集中从每个孔里收集到的细胞。细胞经离心沉淀，用PBS洗一次，再用结合缓冲液（10 mM肝素钠，140 mM氯化钠，氯化钙2.5毫米，pH值7.4）洗一次，然后在室温下在黑暗中孵育在20μL膜联蛋白V-FITC（Invitrogen公司）里20分钟。碘化碘(PI;10微克/毫升; Sigma-Aldrich公司）添加到每一待测的样本, 然后细胞荧光在CyAnADP O2流式细胞仪（Beckman Coulter公司）测量。

PCR定量
根据制造商的指示，使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen公司，克劳利，英国）提取总RNA。然后根据制造商的说明,用SuperScript II逆转录酶（Invitrogen公司）从1微克RNA合成cDNA第一链。PCR定量是在含有1×SYBR绿色JumpStart Taq的准备预混（Sigma-Aldrich公司）和4 pmoles的正向和反向引物的20μL的反应中进行。反应在iCycler iQ上运行（Bio-Rad公司，Hercules，CA）。每个样品一式三份进行了测试,
GAPDH的表达用于样本的规范化。RT-PCR和qPCR引物序列是从发表的研究报告或用Primer3方案（http://frodo.wi.mit.edu/primer3）从目标序列选定的。
用TaqMan低密度阵列卡实时定量分析:
为了评估mRNA的相对表达水平，使用了一个TaqMan人类干细胞多能性的阵列（TLDA）卡（Applied Biosystems公司，灵顿，英国）。根据制造商的指示, 使用高容量的cDNA反转录试剂盒（Applied Biosystems公司）, 使RNA被转录到cDNA. 在TLDA卡的每个端口上装有含有1×的TaqMan通用预混（Applied Biosystems公司）和相应于100 ng总RNA的cDNA的100μL的反应盒。在相同TLDA卡上, 每个样品进行了一次重复测试。用ABI 7900（Applied Biosystems公司）采用热循环。基因表达的相对定量用ΔΔCTmethod计算. 16β-肌动蛋白被用来作为内源性对照以使样品正常化，载体对照样品（0.1％二甲基亚砜）是为相对量化校准的。如果基因扩增的CT值> 36 (即表达水平很低), 则被排除在分析外。

定量细胞的三磷酸腺苷
根据制造商的指示, 使用ATP测定试剂盒（Invitrogen公司）对细胞中总三磷酸腺苷（ATP）进行量化。简言之，Shef6胚胎干细胞与5μM的rottlerin，10μM的rottlerin，或0.1％二甲基亚砜一起孵育2小时。用胰蛋白酶在
37℃作用3分钟以收获细胞，在ES培养液中洗一次,用PBS洗两次。细胞颗粒在0.1 M的NaOH / EDTA中在60°C，40分钟被溶解。然后，200μL预热至100°C的Tris-EDTA添加到细胞裂解液并煮开2分钟。接下来，10μL细胞裂解液放置在一个96孔板的孔里，通过加入90μL荧光素酶溶液使反应开始。光发射立即使用光学板阅读仪（BioTek, potton，英国）进行测量。根据制造商的指示, 使用BCA分析（ThermoScientific）测定蛋白质的浓度, 以计算细胞数目在不同处理之间可能存在的差异.

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