以流式珠为基础的高通量多通路筛选小分子GTP酶抑制剂

应用：肿瘤
基本原理：
小GTP酶是细胞活性的关键调节分子，并是人类疾病特别是肿瘤中应用小分子抑制剂的新型治疗靶点。本实验手册描述了一个多通路的，以流式细胞珠为基础的实验来鉴定并确认小GTP酶的抑制剂或激活剂。六种不同的谷胱甘肽-S-转换酶标记的小GTP酶被绑定在谷胱甘肽的珠子上，每个都贴上了不同红色荧光强度的标签。随后，含有不同GTP酶的珠子将和被试的化合物一同混合并加入384孔板中，被荧光标记的GTP将被读出。这种新型的多通路实验将有助于实验者筛选大约200,000种化合物，同时确认多于1200种的阳性化合物，以便下一步采用6-8通路的实验，进行深入地剂量反应的分析。当假阳性及假阴性的化合物被去除后，少数几个小分子家族的对抗GTP结合活性的化合物被鉴定出来。

方法：
试剂及细胞系：
BODIPY-FL-GTP 2′-(or-3′)-O-(N-(2-aminoethyl) 尿烷，G-12411，延长的金抗褪色试剂从Invitrogen分子探针公司购买(Eugene, OR)。比色的G-LISA实验试剂盒用来定量Rac1/2/3的活性，罗丹明，鬼笔环肽，抗Rac1的单克隆抗体，谷胱甘肽-S-转换酶标记的GTP酶（包括：野生型的Cdc42, Rac1, RhoA, H-Ras及其活性突变体Cdc42Q61L, Rac1Q61L, RhoAQ63L, H-RasG12V）从Cytoskeleton, Inc. (Denver, CO)公司购买。GST-Rab2, GST-Rab7已经纯化，Mouse TruBlort™ Ultra:鼠抗IgG的辣根过氧化物酶从eBioscience, Inc. (San Diego, CA)公司购买。Rac抑制剂NSC23766从Tocris Bioscience (Ellisville, MO)公司购买，EHT1864由A. Kornienko博士(New Mexico Institute of Mining & Technology)提供。多通路实验的珠子是由Duke Scientific Corp. (Fremont, CA)公司合成的，但现在也可通过Thermo Fisher公司订购。其它的试剂均可从Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)购买。鼠啫碱性的白血病2H3 (RBL) 细胞，Swiss 3T3细胞及IgE抗体是由B. Wilson (University New Mexico)博士提供。

多通路初筛
为了多重分析微量GTP酶, 我们采用了7种不同程度红色的直径4微米谷胱甘肽珠。每个聚苯乙烯玻璃粉装置规格为1.4 × 105 beads/µL ,每个玻璃粉大约1.2 × 106个谷胱甘肽单位(用绿色荧光蛋白)。准备蛋白结合时,240-250µL 的每个玻璃粉装置被各自密封,在0.1%的牛血清白蛋白NP-HPS 缓冲液(0.01%体积比的NP-40, 30 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCl, 20 mM NaCl)中并含有1 mM EDTA (NP-HPSE),室温下放置30分钟。离心分离后收集玻璃粉装置,在100µL NP-HPSE 中重悬浮,然后分别用1 µM 已配好的GST-GTPase(Rab2 wt, Rab7 wt, Cdc42 wt, H-Ras wt, Rac1 wt, and Rac1Q61L mutant) 4度过夜培养。每个成对GTPase 玻璃粉用100µL 冰温的NP-HPSE 缓冲液冲洗两次,并补充0.1% BSA 和 1 mM dithiothreitol (DTT),然后冰浴保存在离心管中。把成对的GTPase 玻璃粉快速混合后,在每个健康的实验平板上装入5微升该混合物,然后将0.1微升的检测化合物(1 mM stock in DMSO)加入到各平板中,在把5 µL BODIPY-FL-GTP (200 nM stock in NP-HPSE)加入到各平板中后,最后的化合物浓度达到10µM 和1%DMSO 。阳性对照包含了珠混合物,0.1微升DMSO,和荧光GTP, 放在每个平板的1 号和2号，阴性对照包含了玻璃粉混合物和荧光GTP,0.5mM无标记的GTP作为竞争,还有1%DMOSO, 都被单独分析。用100 nM BODIPY-FL-GTP来演示这个实验，是有一个Kd范围在10到30nM的G蛋白.因为在3到10倍Kd下，演示实验，当1小分子浓度在10 µM时可以注意到50%的抑制，这就是3到10 倍Kd 的价值。在Z的价值的基础上，20%的最低限度的抑制力可以用2-6M范围内Kd值检测出来盘子（玻璃板）放在旋转器上在4摄氏度的情况下温育40-45分钟。样品分析是用如之前描述的大流量细胞计数来做的。细胞计数的量少量散射（分散）而且以530 ± 20 nm (FL1) and 665 ± 10 nm (FL8)及665 ± 10 nm (FL8)发射荧光，被收集到青二氢磷酸氨的细胞计数的流量上（Beckman Coulter, Fullerton, CA）384个好盘子的筛检需要花费15分，完全的文库筛检可以在8周内完成。用IDLQuery软件决定化合物在小孔的活性，结果按时间数据来分析。以FS和SS为基础的参数被使用于识别单线态珠的数量。以FL8排放为基础，区别于涂有不同蛋白质的珠子，而且计算每个珠子的中值荧光。如果在活跃时改变较大，然后20%来自于基线，则次化合物被称作蛋白激活分子。基准线被定在以100%测量值为基础，测量值来自于包含正调控的1%DMSO，在数据库做进一步描述。

剂量反应的测量值
在初筛上经进一步分析鉴定，待测化合物是从混合存储板中择优挑选出来的，然后从10mM的初始浓度连续的按1:3稀释8次，产生9点稀释阶梯。本实验最终的浓度范围从10nM到100µM。如前所述，小珠在复用初筛部分被涂上一层蛋白质。我们可以使用1 多倍仪来进行剂量反应分析(Rab7 wt, Rab2 wt, H-Ras wt, H-RasG12V, Cdc42 wt, and Cdc42Q61L)和3 单一镜像。(Rac1 wt, Rac1Q61L, and GST-GFP)。在包含镁的实验中，我们使用含1mM的MgCl2 NP-HPS缓冲器。8 GST-GTPases在一个单一多倍仪(Rac1 wt, Rac1Q61L, Rac2 wt, RhoA wt and RhoAL63, Cdc42 wt, Cdc42Q61L and Ral wt)中同时被鉴定，而且100nM BODIPY-FL-GTP粘合物在存在或缺少一系列药物稀释系列中被测量。每个剂量反应系列被一分为三。

动力学分析
野生型GST-Cdc42 (4 µM)在4°C下被束缚在GSH-beads一夜。在30°C下20 分钟，包含缓冲器的10 mM EDTA，在GSH-beads上的 Cdc42被核苷酸耗尽，用NP-HPS缓冲液洗两次，然后悬浮在含有1 mM EDTA, 1 mM DTT, and 0.1% BSA的同样的缓冲液中。动力学分析显示，用DMSO (1%最终浓度)或者10 µM MLS000532223孵化50µL的GST-Cdc42-GSH-bead悬浮液2分钟，随后添加50 µL的冰冷的各种浓度的 BODIPY-FL-GTP。在动力学模式下，使用FacSCAN流动细胞计数器测量联合荧光核苷酸。此项目平均数是150per s。使用IDLQuery（免费从作者那获得软件）将数据转化成ASCII格式。使用GraphPad Prism软件输出策划未加工的数据。

Rac激活实验
在细胞基础实验中，Swiss 3T3细胞总是通过MLS000532223来监控Rac1抑制。细胞一晚血清饿死，然后用1% DMSO（负调控）或在10 µM DMSO（1%最终浓度）化合物处理20到30分钟。当正调控时，用10 ng/mL表皮生长因素（EGF）处理2分钟。细胞溶菌作用，免疫沉淀反应的积极Rac1，用GST-PAK-PBD固化在GSH珠，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，如上所述免疫印迹。

活化Rac的G-LISA™实验
按照标准流程对Swiss 3T3细胞进行饥饿培养(Cytoskeleton, Inc., Denver, CO)。在6-well dishes的个体培养用浓度范围在0.1到10µM的MLS000532223孵化一个小时，随后用10 ng/mL EGF刺激2分钟。细胞用冰冷的PBS冲洗，PBS包含钙，镁和深层加工的蛋白质和G-LISA™实验。正调控包括工具箱提供的Rac1-GTP和细胞溶解产物，由只用EGF控制刺激的细胞制备。

活细胞显微镜
活细胞显微镜用来观察RBL-2H3 细胞。细胞在盖玻片上生长一夜，用Tyrode缓冲液清洗，覆盖(10 mM HEPES [pH 7.4], 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.4 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5.6 mM glucose, and 0.1% BSA)。在37°C下在100分钟内每隔60秒加入10 µM MLS000532223（最终浓度）后，拍摄时滞图片。配合基刺激中，用1 µg/mL 2,4-二硝基酚 (DNP)–BSA。用Bio-Rad 辐射2100聚焦显微镜，装备有一个60 × 1.4 NA油浸物镜，物镜配备有 lasersharp3000软件。

荧光免疫检验法着色和显微镜
RBL-2H3细胞在载玻片上生长和培养一夜，在10 µM MLS000532223存在或者缺少情况下。当正调控时，如前所述细胞被1 µg/mL DNP-BSA刺激30分钟。细胞用PBS清洗，用3% 的多聚甲醛固定，用0.1%的Triton X-100在Tyrode缓冲液中透化五分钟，用1% BSA在Tyrode缓冲液中阻碍一小时，然后再用若丹明-鬼笔环肽染色一小时。所有的繁殖均在室温下。在成像来看，使用Prolong gold anitifade 试剂使样品在载物玻片上增加。一个A Zeiss LSM 510 显微镜，40×的物镜，被用于收集图像。

β-己糖胺酶分泌物测量
为了检测β-己糖胺酶的释放量,细胞用免疫球蛋白E包被在24孔板中隔夜培养。IgE培养的细胞在台式缓冲液中用已经浓度的抑制剂冲洗和培养一个小时，等份试样(100µL)的细胞培养上清液用来分析自然释放的X的量。 将细胞暴露在1 µg/mL DNP-BSA的台式缓冲液中， 37度处理30min, 使细胞活化。β-己糖胺酶的释放量如 Ortega等人的描述的方法进行计算。其值根据采用的1% Triton X-100的台式缓冲液的不同，计算总量中β-己糖胺酶的百分比。

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