基于全细胞荧光分析的DPP1抑制剂筛选

潜在应用：COPD （慢性阻塞性肺病）

基本原理:

二肽基肽酶(Dipeptidyl peptidase 1 , DPP1) 是一种溶酶体木瓜蛋白酶家族的半胱氨酰蛋白酶参与细胞内蛋白质降解，并且是慢性阻塞性肺病的较感兴趣的靶点。目前，仅有离体的DPP1酶活性分析，主要方法是用合成的底物如二肽或肽连结到氨基-甲基-香豆素或其他荧光基团上。然而，目前还没有简易的基于全细胞的分析方法检测溶酶体DPP1活性除了使用基于侵入性活性探针或生理的产物如中性粒细胞弹性蛋白的产生。体外重组酶活性分析存在一定缺点。作者研究了许多DPP1荧光底物，探讨了作为进入溶酶体增强体内检测DPP1酶活性的潜在可能性。这个实验方案主要介绍一种简易的非侵入性的使用底物H-Gly-Phe-AFC检测新鲜的或冷藏保存的人THP-1细胞中DPP1活性荧光分析。这种基于细胞的荧光分析方法可以在96孔板中进行操作并可作为理想的适合检测细胞DPP1抑制剂。

方法:

材料
所有分析试剂及细胞生长所用培基购买于 Sigma-Aldrich，H-Gly-Phe-AFC购于NeoMPS, Polypeptide Laboratories Group (San Diego, CA)，H-Gly-Arg-AMC购于Bachem (Bubendorf, Switzerland)。 (Gly-Arg)2-rhodamine 合成于 Medicinal Chemistry Department at AstraZeneca R&D Charnwood (Loughborough, UK) ，一个 GSK DPP1 抑制剂专利 WO 2006094003。Human recombinant DPP1 (hrDPP1)生产于DECS Group at AstraZeneca R&D (Mölndal, Sweden)。

培养和冷冻保存的THP-1细胞
THP-1 人单核粒细胞性白血病细胞，来自于 American Type Culture Collection (TIB 202 F-11838; ATCC, Manassas, VA) 。生长条件是RPMI + 1% (v/v) glutamine + 10% (v/v) fetal calf serum (FCS) ，37°C ，5% CO2 培养箱。在合适的生长密度，收集THP-1细胞并重悬于PBS中(pH 7.4) 。冷冻的THP-1细胞密度约为1.0 × 107/mL，冻存条件为 80% (v/v) of FCS, 10% (v/v) DMSO, and 10% (v/v) 生长培基 (RPMI) ，−150°C。在分析之前，冻存的细胞于37°C 水浴复苏，300 g 离心5分钟，去除冻存液，以合适密度重悬于PBS中。新鲜的或冻存的细胞要求有95%以上的细胞活力，用 Cedex cell counter检测 (Trypan blue uptake)。

DPP1 酶活性分析
重组人DPP1酶活性分析主要检测氨基-甲基香豆素或氨基-氟香豆素底物肽释放出的酶活性，氨基-甲基香豆素荧光密度Ex λ350 nm 和Em λ450 nm，氨基-氟香豆素 Ex λ400 nm 和 Em λ505 nm。检测过程在黑色384孔板中，终体积为50 µL，温度为22°C。分析条件包括：assay buffer (25 mM piperazine buffer, pH 5.0; 50 mM NaCl, 5 mM dithiothreitol [DTT]; 0.01% [v/v] Triton X-100), 100 µM H-Gly-Arg-AMC or H-Gly-Phe-AFC (~equivalent to Km), and hrDPP1 (~0.1 nM)。化合物溶解于DMSO中并稀释在分析缓冲液里，使得DMSO终浓度为1% (v/v)。以10为底的半对数稀释方法稀释抑制剂，用4参数logitic非线性拟合方程计算pIC50 。标准的非可逆选择性DPP1抑制剂(vinyl sulfone [VS])作为该分析方法的阳性对照。常规来说，在加入底物肽之前，先把化合物与重组DPP1预孵育30min，再开始反应，然后放置于22°C孵育60min。此后，空板迅速置于荧光读板仪上，使用合适的激发光和发射光波长读数。用基于Michaelis-Menten的方程计算底物Km 。

DPP1 细胞分析
该分析在 96孔板中进行 (Corning Costar; Corning, Lowell, MA)。10 µL 分装的化合物 (10-point half-log concentrations) 或 10 µL 5% (v/v) DMSO 阳性对照或 10 µL VS (final assay concentration [FAC], 10 µM) 阴性对照加到合适的孔中。随后加入 30 µL 1.0 × 106/mL PBS重悬的 THP-1 细胞加到所有孔中。置于37°C 细胞培养箱中孵育60 min ，加入10 µL H-Gly-Phe-AFC (FAC 100 µM ~equivalent to Km) 开始反应。反应产物在荧光孔板读数仪上读数Spectramax Gemini (Molecular Devices, Sunnyvale, CA; Ex λ400 nm, Em λ505 nm)。在实验过程中，细胞活力要求降低程度<5%。化合物的pIC50用4参数logitic非线性拟合方程计算。标用基于Michaelis-Menten的方程计算底物Km 。许多蛋白酶或溶酶体抑制剂，如bafilomycin A1, cystatin, elastase, cathepsin L, and cathepsin K都可以用来做THP-1细胞DPP1分析。作为对照，另外两个底物(Gly-Arg)2-rhodamine 和 H-Gly-Arg-AMC可用上述方法在THP-1细胞中进行，(Gly-Arg)2-rhodamine荧光检测条件为Ex λ485 nm and Em λ535 nm。

用H-Gly-Phe-AFC在THP-1细胞中进行DPP1成像
该分析在 96-well Biocoat collagen type 1 板中进行(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)。在100µL的体系中，分析成分包括 10 µL H-Gly-Phe-AFC (FAC 100 µM), 10 µL of DraQ-5 dye (FAC 2 µM; Biostatus, Leicester, UK), 10 µL of DMSO (FAC 1% [v/v]), 70 µL PBS重悬的THP-1 (i.e., final 56K cells)。孔板置于 ImageXpress 5000a (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA)成像。用20× PF ELWC objective抓拍图像。DraQ-5 作为细胞核marker 区别于荧光信号 H-Gly-Phe-AFC。 DraQ-5 使用λ700-75 nm 发射滤光片λ620-60 nm 激发λ660 nm long-pass (LP) 分色镜成像。DraQ-5 曝光时间为 250 ms.。H-Gly-Phe-AFC成像用λ535-50 nm发射滤光片, λ360-40 nm 激发，λ505 nm LP分光镜，曝光时间为150 ms。H-Gly-Arg-AMC成像用类似条件抓拍。 Hoechst 33342 作为细胞核marker在下面的采集过程中是使用：发射滤光片λ460-50 nm，激发为λ360-40 nm, λ400 nm LP 滤光片, 曝光时间为50 ms. H-Gly-Arg-AMC 成像发射滤光片为λ620-60 nm，激发为λ570-20 nm, λ585 nm LP 分光镜及100-ms 曝光时间。

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