噬菌体展示技术筛选单链抗体的方法

这是综合汇编并验证修改的方法。对于具体项目，可作相应的修改。
1. 细菌宿主细胞的准备:

在新的筛选过程开始之前, 从冻箱中取出TGI 细胞, 接种到M9 小量琼脂培养平板. 在37 c 中培养一个晚上, 然后把平板密封闭并储存在4c 冰箱里。在含50 ml 2x YT 液体的250 ml 的烧瓶里接种单个克隆的TGI细胞( 在每一次筛选中, 至少需要10 毫升细胞培养液. 如果需要的话, 可接种更多的烧瓶).

另一种方法: 在筛选前一天, 接种10 毫升单克隆TGI 细胞到一个50 毫升的Falco 管， 在37 度中以280 转/分的速度旋转培养过夜。 在进一步洗脱噬菌体之前约3 小时,把50 毫升2xYT加入含有250 微升经过一夜培养的TGI 细胞液，并把它放到37 度中离心(280转/分)培养，用OD600 控制其生长。当细菌生长达到中等对数期(OD600=0.5-1.0, 约5x108细胞/毫升)时, 马上使用这个培养液.要不然, 把这个培养液放在冰里直到需要把噬菌体提出进行感染 (6.1 章) 或是滴定(7.2及 7.3 章).

2. 抗原的准备:

在DDI 过程中使用已定的程序, 详细记录在此次项目中使用过的所有抗原和对照抗体.

2.1 生物素标记抗原

按照产品提供的步骤用Sulfo-NHS-LC-Biotin 反应计(Pierce 21335) 生物素标记约100微克抗原。我们的目的是使每个抗原接合2 个生物素。在反应中用超过10 倍克分子浓度的生物素反应计算, 并用去盐旋转柱去除没有反应的生物素。用生物素定量测定器材来确定生物素比抗原的比例。只有生物素酰化超过1,且抗原溶解低于总数的20% 的抗原才被认为合格。如果生物素标记不合要求, 应重新生物素标记，并适当调整生物素酰化计的克分子浓度。
质量控制:
把生物素标记的及非生物素标记的抗原排列在 (1) PAGE: 观察降解及聚集;(2) 8 个一组: 观察其与链霉敏感性的特异结合; (3) 用任意的一种抗原特异性功能或结合的测试来观察不变的功能.
生物素标记的抗原用于 5.1.3 章.

2.2 固相涂层抗原微孔板筛选

抗原涂层饱和度测试采用ELISA应用Maxisorp 或类似的高结合平板做的。试验准备11 个抗原用PBS 做2 倍稀释(从 10 微克/毫升稀释到0.01微克/毫升);每一种稀释度三个样品,另外加对照(无或用不相关的抗原),每个样品50 微升稀释液，在4度培养一个晚上。封闭微孔板, 用相应的第一、二、抗体来检测抗原.如果可能的话, 可用一系列的商品化的抗体来检测不同的表面抗原决定簇。注意不同抗原的饱和度范围.如果在最高浓度时看不到ELISA 的饱和度信号, 可试用其它非PBS 的缓冲剂, 同时应重复饱和度的测试过程。
涂层-每一次筛选,（不同噬菌体抗体库或实验条件）, 每孔涂200微升饱和浓度的抗原, 并在4度下过夜。用300微升4% 脱脂奶粉封闭微孔板，室温1 小时，然后用PBS 缓冲液清洗。这种涂了抗原并封闭好的微孔平板用于5.2 章.

3. 准备噬菌体抗体库:
在筛选的所有步骤中使用相同的封闭液。
封闭液:
筛选生物素标记抗原用含有4% BSA (Sigma, A7030) 的 PBS-LT (0.01% Tween 20, PBS)
固相筛选用用含有4%脱脂奶粉的PBS-LT (Bio-Rad 170-6404)

3.1第一轮筛选:

把噬菌体抗体库的抗体, 按50μL（1E12）等份分装，每次用一管，不要把抗体库混合到一起。把所用的那管抗体简单的离心一下，把抗体加入装含有150 微升4% 封闭液的1.5毫升 Eppendorf 管中进行封闭，室温下放置1 小时，取10微升用于输入滴定.

另外一种方法:
抗体库中所有的抗体 (Kappa & Lambda) 都按约150微升(1E12)分装。每次筛选时，从每个抗体库中取出相同剂量进行混合。取一管简单离心后，把 Kappa 和 lambda的抗体库混合在一起, 并加入PBS 到800 微升， 再加入200 微升PEG/NACL, 在冰中放置 30 分钟。然后在4 度中用24000xg 离心 10 分钟，小心缓慢地尽可能地吸去除上层漂浮液，然后在 1.5 毫升Eppendorf 管内用吸量器吸动，使沉淀物重新悬浮到200微升4% 封闭液，室温下放置 1 小时，千万不要用旋涡器，最后取出10微升用于输入滴定。

3.2 余下的筛选步骤:
把50微升2 次 PEG 沉淀的噬菌体(6 章) 混合到 150 微升4% 封闭液;室温下培养1 小时;取 10 微升用于滴定.

4.抗体库的准备:
在所有的筛选步骤中, 用相同的固定液.
固定液:
筛选生物素酰化的抗原: 用PBS-LT(0.01%Tween 20,PBS) 含有4% BSA (Sigma, A7030).

固相筛选: PBS-LT (BioRad, 170-6404) 加有4%脱脂奶粉.

4.1, 筛选的第一步:
. 把抗体库等分为50微升(1E12)一份. 每一份用于每一个筛选, 不要混合抗体库.
. 简单离心每一份抗体库.
. 在 1.5毫升Eppendorf 管加150微升4%固定液. 再加入抗体库以固定抗体库.
. 在室温下培养 1小时.
. 取10微升用作输入滴定.

另一种方法是:
把 Kappa 和 Lambda 抗体库都等分为150微升(约为1E12). 每一次筛选用从每个抗体库混合的一份.
. 简单地离心每份抗体库.
. 混合Kappa 和Lambda抗体库, 再加PBS 到800微升.
. 加200微升 PEG/NaCl, 然后在冰上培养30分钟.
. 24000xg 4C下离心10分钟.
. 小心缓慢地尽可能地去除所有的上清液.
. 在1.5毫升Eppendorf管里用吸量器重新悬浮沉淀物到200微升4%固定液.
. 室温下培养1小时.
. 取10微升作输入滴定.

4.2. 筛选的随后步骤:

. 混合50微升双重PEG-沉淀的噬菌体(来于6章)到150微升4%固定液.
. 室温下培养1小时.
. 取10微升作输入滴定.

5.0 筛选

5.1 用King Fisher 液相筛选
5.1.1. 封闭用链霉包裹的磁性珠子(Dynabeads) 来取消选择和筛选.
每一个筛选用50 微升磁珠
. 在原有的容器内用旋涡器混合珠.子
. 吸 50 微升珠子到Eppendorf 管, 放入磁柱并去掉储存时的缓冲液.
. 用1毫升 PBST 清洗, 洗3 次. 即: 用吸量器使珠子重新悬浮, 让磁柱
收集珠子并去掉清洗液.
. 把洗过的珠子重新悬浮到200微升4%的封闭液(相同于封闭噬菌体抗体的
液体).
. 在摇动器上室温培养一个小时.
. 用手轻弹管子以便收集管底的液体.
. 把整管的悬浮液加到磁柱里以收集磁珠和去掉封闭液.
. 用50 微升PBS-LT 重新悬浮磁珠.

5.1.2. 在King Fisher 平板去除抗体库的选择 (为去除磁珠特异性的噬菌体)
. 把干净的管子放入磁柱, 加入25 微升封闭的磁珠.
. 去除缓冲液,加入200 微升封闭的抗体库并用吸量器混合.
. 把混合的液体倒在 King Fisher 平板A 行.
. 在 King Fisher 平板的B行倒入200微升PBS-LT.
. 进行去除选择的程序( 混合 1 小时, 把磁珠转移到B行).
. 从A行收集去除选择的抗体库, B行的磁珠丟弃.

5.1.3. 在 King Fisher 平板中筛选

每一柱( 有8 个孔) 只用于每个单一的筛选过程,从平板中去掉没有用的柱.
用 Trypsin 洗脱 (CATtryp 抗体库) 和用 HCL 洗脱( Dyax 抗体库) 程序的筛选分别使用不同的平板.
. 混合 25 微升封闭的磁珠和175 微升PBST, 并放入平板B 行.
. 分别加200微升PBST 到C 行和D 行.
. 分别加 200微升PBS-LT 到E, F, 及G 行.
. Ｈ行空着，直到King Fisher 筛选项目需要时．
．把去掉选择性的抗体库（５．１．２章）及１５pmol　生物素酰化的抗原混合（３．１　　章），然后加进Ａ行．
．把平板放入King Fisher 仪器，并按照其指示（同时也附在此文件中，用第一个SoluSolid_HCLTrp 程序来做筛选的第一步．根据需要，用第二个或者第三个SoluSolid_HCLTrp　程序来做筛选的

其它步骤．
．为洗脱CATtrp抗体库,用０．１Ｍ的磷酸钠（pH=7）稀释（１：５００）冰冻的Trypsin　部分．然后马上加到平板的H 行.
. 在H 行洗脱噬菌体.
. 小心! 用HCL(Dyax 抗体库洗脱噬菌体的程序结束后需要马上进行中和.
. 取10 微升用于输出滴定.
. 把洗脱的噬菌体储放在冰里直到准备扩充.
(*) 磁珠的最大结合能力取决于抗原的大小. 25 微升磁珠最多能结合16.6 pmol IgG 或50 pmol 生物素酰化的肽链(缩氨酸). 15 pmol 150KD 蛋白质是22微克, 15 pmol 15 KD 蛋白质是0.22 微克, 15pmol/200 ul 是75nM.
5.2. 用微平板进行固相筛选
. 把封闭的抗体(4 章) 加入到涂有抗原的单个孔里, 并封闭微平板(3.2 章).
. 在室温下静止状态培养1小时.
. 用PBS 人工手洗培养孔5 次, 再用PBS-LT 洗5次.
. 用新鲜配制并稀释的Trypsin 洗脱CATtrp 抗体库噬菌体(200 微升,10微克/毫升, 30 分钟, 37C). 用兵HCL 洗脱Dyax 抗体库(200 微升, 0.1M HCL, 5 分钟在室温,然后移到加有65微升, 1M Tris pH=8 的Eppendorf管中.
. 取10 微升用于输出滴定.
. 存于冰中直到准备进行感染指(6 章).

6. 洗脱噬菌体的扩充

6.1. 筛选物划碟 – 第1 天(即筛选的同一天, 5 章)
. 把100 微升TGI细胞培养液涂到培养皿中作为没有感染的细胞对照.
. 把全部洗脱的噬菌体(5章)放入50 毫升Falcon 管里, 加10微升TGI 细胞培养液 (2 章), 在37C 中缓慢摇动150 转/分 1 小时.
. 用70微升感染的TGI 细胞做克隆挑选仅用于第2和第3步的筛选步骤.
. 把Falcon管里余下的细胞在2500 转/分离心15 分钟.
. 用 2 毫升2XYTCG(2X YT+100 微克/毫升卡苯尼西林及2%葡萄糖) 重新悬浮沉淀物. 然后把细胞涂于2XYTCG BioAssay 琼脂平板.
. 把100 微升无感染的TGI 细胞对照涂在2XYTCG 小培养皿上.
培养过夜后,这个培养皿应该没有细胞生长.
. 把所有的培养皿置于30 C 过夜.

6.2. 筛选物的扩充 – 第二天
. 用细胞刮刀把细胞从BioAssay琼脂平板上刮下, 并用强烈的旋涡方式把细胞重新悬浮与加有10毫升2XYTCG的50 毫升管里.
. 取2 个800 微升的细胞悬液放于标记好的低温管中, 再加400微升50% 的甘油.混合之后把这些加有甘油的储备细胞置于-80C(筛选物的备用品).
. 找出细胞悬浮液的OD600(要精确的测定OD600, 必须充分稀释样品, 使测定值保持在0.06-0.6 之间).
. 把细胞接种到装有50 毫升2XYTCG 的250 毫升烧瓶里. OD600 在开始时应在0.05-0.1 之间,
. 把细胞培养在37C 280转/分使OD600 达到0.5-1.0 的范围.
. 从这种细胞培养中取10 毫升加到预热在37C 的50毫升管子里, 丢掉剩余的.
. 在MOI=20 时,加入辅助噬菌体(M130K07 用于Dyax, M13K07trp 用于CAT 抗体库). 当OD600 =0.5 时,加5E10 噬菌体到10 毫升TGI 培养液.
. 在150 转/分的缓慢转动中继续37C培养一小时.
. 用2000xg离心10 分钟.
. 尽量去除并丢弃上清液, 用吸量器在1毫升2XYTCK(2XYT+100微克/毫升卡苯尼西林和50微克/毫升卡那霉素里重新悬浮沉淀物.
. 把1 毫升细胞接种到装有25毫升2XYTCK 的250毫升烧瓶里. 在25C中用 280转/分生长过夜.

6.3. 收获及净化扩充的噬菌体—第三天
. 把细胞培养物转移到一个50 毫升管中并在冰中稍微冷却,
. 用实验台上(小)离心机在4C下以4750转/分离心30分钟. 如果上清液是混浊的, 把它 转入另一个干净管子里并重复这一步骤.
另一种方法是用地面(大)型离心机在4C下以8000转/分离心20 分钟.
. 把20毫升上清液(不要搅动细胞沉定物)转入到另一个新的50毫升管里, 加5毫升PEG/NACL 混合, 然后在冰中培养一小时.
. 在4C下用4750转/分离心15分钟.
. 小心地去除所有的上清液.
. 加1毫升PBS-LT, 用吸量器重新悬浮沉淀物. 然后转入Eppendorf管.
. 4C下用24000xg离心10分钟, 以去掉残留的细菌.
. 取800微升上清液于200微升PEG/NACL混合. 在冰中培养15分钟.
. 4C下4000xg离心10分钟以收集噬菌体.
. 小心吸去并丢弃所有的上清液.
. 用吸量器使沉淀物重新悬浮于0.1毫升PBS-LT中并转入另一新的Eppendorf管.
. 4C 下24000xg离心10 分钟以去掉剩余的沉淀物.
. 把上清液装入一新的管子里. 这就是双重PEG-沉淀的噬菌体,用于4.2.章.

7. 测定筛选的输入和输出

7.2 的方法是用于测定输入和输出滴定. 由于输入滴定相当高,输入噬菌体必须象7.1. 描述的那样稀释.
7.3.的方法用于在第二及第三轮筛选之后做克隆的挑选

. 筛选输入滴定: 用PBS-LT 稀释 10 微升封闭的噬菌体(4 章, 含有约5E10 cfu), 3 次乘以系数100 (10 微升+ 990微升->10 微升+990微升->10 微升+990微升, 加10 微升(约5E04 cfu)到A 列(7.2 章).
计算输入滴定用 7.2 章的公式, 再用得数乘以1E06. 这就是噬菌体cfu在190 微升筛选所用的封闭的抗体库中(4章)的数量.
*例如, 有5个噬菌体在G 列, 输入噬菌体的滴定就是1.95E06(5*380*4-5)输入抗体滴定应是1.95E12,

7.2. 一个培养皿滴定的方法:

这个方法用于在96 孔平板中最多有12个噬菌体样品的滴定.
稀释液被点进一个单一的大的琼脂培养皿. 每一个滴定有84倍稀释, 从2E08到4E02之间的滴定都包括了.
. 稀释平板, 用低容量, 象PCR, 96孔培养板.
, 用尽量多的柱 (1-12), 如果你有很多噬菌体需要数.
B-H 列每孔加15 微升PBS-LT. 加10微升噬菌体裁(5.1.3, 5,2, 及 7.1.章)

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