用HTS 筛选组蛋白乙酰转移酶抑制剂

主要适应范围: 抗白血病的后生癌症药物

基本原理和流程图: 实验胚胎的畸变正引起越来越多的关注,因为它可能是在癌症发展中的关键因素..
近来, 组蛋白乙酰转移酶的不正常已与几种类型的癌症联系起来了. 单核细胞白血病锌指蛋白(MOZ)是组蛋白乙酰转移酶MYST家族中的一个成员.MYST酶系通常调节基因在细胞增殖和分化的表达. MOZ组成的活化引起白血病干细胞的形成,使得MOZ成为一个极好的治疗髓细胞性白血病的指标.这个程序表达了一个有力的同质化测验来测量合成的组蛋白乙酰转移酶的组蛋白肽底物的乙酰化. 初步筛选是要找出抑制剂, 而二级反筛则是用于消除干扰检测的化合物, 从而进一步证实抑制剂.

方法和程序:
. 蛋白质的表达和纯化: 人类MOZ的MYST 片段(507-778 残基)是通过一个N-终端融合蛋白质与E.coli衍生的NusA溶解性标记连接于一个His6. 通过镍固定的金属离子亲和层析(Ni-IMAC)进行蛋白质纯化. 为了产生一个pNusA-His^-hMOZ表达载体, 一个cDNA序列编码这些不同的区域, 通过PCR进行扩增. 使用的引物有侧翼5’Ncol 和3’Notl双酶切点. 然后克隆到一个pETM60衍生的载体里. 如果使用表面等离子体共振(SPR)实验, 人类MOZ来于MYST区域(残基497-780)被表达为一个N-终端His6融合的蛋白质(从结构基因组学联盟获得, 同意号D12-APC027).同样, 对于SPR实验, 人类MYST来源的MOZ区域(残基 177-447)被表达为一个连接N-终端His 6-标记的融合蛋白. 为了产生pHis6-hMOF表达载体, 把侧翼有5’Ncol 和3’Notl 双酶切点的引物用PCR扩增这两个区域并克隆进一个pProEXHTa 载体(Invitrogen, 卡尔斯巴德, 加州).
. 为进行蛋白质的生产,pNusA-His6-hMOZ. pHis6-hMOZ 及 pHis6-hMOF表达的载体被转化进 E.coli BL12(DE3)细胞. 把这样产生的菌株培养在一个10升大的布劳恩Biostat B 发酵瓶,并用0.1mM异丙醇1PTG诱导在15C过夜.

. 为高通量筛选而进行NusA-His6-hMOZ的纯化
一个37克(湿重)的大肠杆菌细胞沉淀物被重新悬浮在200毫升裂解液(25mM Tris (pH8), 500mMNaCl, 0.02% 叠氮化钠,0.01% Triton-X100, 5%甘油, 10mM 咪唑,5mM 二硫苏糖醇(DTT), 加上蛋白酶抑制剂片(Roche,Basel,),20 微升 Benzonase (Merck, whitehouse Station,新泽西州), 100 毫克溶菌酶(Sigma, St.Louis,密苏里州)). 细胞在冰上搅拌1小时,然后让细胞通过一个Avesstin C5细胞匀浆器以15,000psi 3次进行机械性溶解. 由此产生的细胞裂解液用48,000g离心20分钟. 上清液用5微米过滤器过滤. 这种NusA-His6-hMOZ蛋白质然后在一个5毫升HisTrap柱上利用Profinia蛋白质纯化系统(Bio-Rad, Hercules, 加州)纯化. 随后是两步凝胶过滤步骤,先是一个Superdex 200 26/60 柱, 然后是一个Superdex 75 16/60别(GE, 医疗). 总的说来, 用这种方法从37 克E.coli沉淀物最后在最终缓冲液(25mM Tris(pH8), 500mMNaCl, 0/02%叠氮化钠, 5%甘油, 及,5mM DTT) 里生产出约15毫克纯化的NusA-His6-hMOZ蛋白质. pCAF酶购自Millipore(比尔里卡,马萨诸塞州).

. 小分子抗体库
WEHI 93K HTS 和CRC-CTx 153K HTS 的抗体库用于这个实验. 其实任何其它的小分子化合物抗体库既使有些适当的变异也可以使用. 简言之, 从不同的产商淘汰铅样化合物, 而其它化合物85% 以上类似于任何其他产商, 按照Tanimoto系数进行判簖并进一步考虑去除. 采用功能组过滤器以消除活性化合物. 额外的检测干扰过滤器用于CRC-CTx 153K HTS抗体库最终步骤之前. 化合物溶解在干净的DMSO, 并以5mM的浓度储存在可控气压条件下(TTP LABTECH 化合物, 墨尔本, 英国)

. HAT 活性:
不同酶的HAT活性测定使用以AlphaScreen 为基础的检测方法(珀金埃尔默, 马萨储塞州沃尔瑟姆). 这个试验反应在 384 孔低容量检测板以8微升的容量进行(格雷纳, Frikenhausen, 德国或康宁,洛厄尔, 马萨诸塞州). 反应在检测缓冲液(100 mM Tris-HCL (pH7.8), 15mM NaCl, 1mM EDTA, 0.01%Tween-20, 1mM　ＤＴＴ，及０．０２％Ｍ／Ｖ鸡蛋白蛋白)里进行. 除非另有说明, 反应用 15ｕＭ　ＡｃＣｏＡ（Ｓｉｇｍａ），５０ｎＭ　Ｎ－终端组蛋白Ｈ４肽链(序列SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV-GGK-生物素, Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司)．１０ｎＭＭＯＺ酶及乙酶-赖胺酸-特异性抗体(ａ－ＡＣＫ（最终稀释度1:3500）细胞信号技术, 丹佛斯,ＭＡ;ａ－Ｈ４ＡＣＫ８－１(最终稀释度 50納克/毫升)，Ａｂｃａｍ, 英国剑桥; ａ－Ｈ４ＡＣＫ８－２(最终稀释度 1:3000)　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司).
. 在第一步的HTS试验中,15纳升抗体库化合物被干撒在从第1到第22列的测试板. 而第23和24列则加入同等量的DMSO. 使用这些准备好的测试平板允许化合物储存中心在底物和酶被快速不断地添加进去之前能进行较大批量的准备和运输.

. 对于随后的试验, 用DMSO进行抗体库化合物的11 点稀释系列.在加入酶启动反应前, 100ｎＬ容量被一针型工具加进含底物的测试平板. 在所有的平板上都要进行阳性(无底物)及阴性(AｃＣｏＡ去除)对照反应, 并如同化合物处理的反应孔,用相同剂量的DMSO.

. 在加入所有的试剂后, 平板用粘合剂密封, 然后室温下培养60分钟. 4微升额外的缓冲液(含有最终浓度为4微克/毫升的AｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ受体珠及链霉亲和供体珠(珀金埃尔默))被加入, 培育5 小时后,用一个ＥｎＶｉｓｉｏｎ２１０３多标记平板翻译仪按照HTS AｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ模式进行读取(珀金埃尔默). 每一个抗体库化和物的抑制百分比相对于每个平板的阳性和阴性对照基础上计算出来.

. 滴定试验
IC50 值取决于恰当的抑制百分比与化合物的浓度(双重的11点稀释) 对一个4参数的计算方式.
. 监督检测质量: Z 因子测定

滴定CｏＡＳＨ－它不溶于DMSO里.在测定缓冲液里加入20 ｍＭ的原液. 取0.5微升加入反应孔. 对于某些试验,ＴｒｕＨｉｔｓ珠(珀金埃尔默)被用于测定对检测方式的干扰.

. 辐射的测定:
HAT的活性及小分子的抑制活性基本上象以前描述的那样用辐射试验进行测定. 简言之, 用1.5微克重组的组蛋白H3.3和H4 (Nｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ，　Ｂｉｏｌａｂｓ，　Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ) 与120纳克纯化的NｕｓＡ－Ｈｉｓ６－ｈＭＯＺ融合再一起在HAT 缓冲液里(50ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）．５０ｍＭＫＣｌ，　０．１ｍＭＥＤＴＡ，　５％甘油,１ｍＭＤＴＴ)培养. 加0.125微居里ａｃｅｔｙｌ－１－１４Ｃ－ＡｃＣｏＡ（珀金埃尔默）, 使得总容积为30微升,在30C培养30分钟. 加进额外的Lａｅｍｍｌｉ缓冲液, 并在10% Bｉｓ-Tｒｉｓ（２－３）聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）解析每一种反应的一半之前煮沸5 分钟以终止反应. 在凝胶被Pｈｏｓｐｈｏｒ筛选前要干燥24-48 小时. 然后使用富士的FLA-3000成象仪(富士, 东京, 日本)成象. 此外, 在干燥前, 用SａｆｅＳｔａｉｎ把蛋白质在电泳中的痕迹染色进行可视化加载.两种图象用IｍａｇｅＪ(国家卫生研究院, 贝塞斯达, 马里兰州)进行定量. 对于相关的蛋白信号而言, 14碳信号是标准..

. 用生物感应表面等离子体共振测定化合物的特征.

用一个BiacoreT 100系统(GE Healthcare)进行化合物结合特征的测定

按照制造商的建议, 用一个基本的胺偶合链霉亲和素并固定到一个CM5芯片上.靶蛋白质MOZ及一个对照蛋白质被1:1 克分子比例的磺酸基-NHS-LC-LC-生物素(ThermoScientific,罗克福德,IL)有限标记,测定其非特异结合, CSF1-R激酶的结构区域.用体积排除色谱从非混合试剂里纯化这些蛋白质,成并固定在泳动的缓冲液里(50mM HEPES (pH7.5), 150mM NaCl, 10mM MgCl, 5mMDTT, 0.05%Tween-20, 5% DMSO). 在链霉亲和素芯片表面, 在4C和100uM浓度时, 化合物被分别注射进这些点里. 除了溶剂校正外,参考通道的信号被从蛋白质通道的信号里减去. 用洗涤软件(www.biologic.com.au)进行数据处理和分析.

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