适用于筛选其它的粘合剂（结合剂）

筛选流程图:

. 重组靶蛋白Bcl-2的制备(首先是GST-融合, 然后是无GST的蛋白)
. 筛选噬菌体库
. 分离过紧的粘合剂
. DNA测序以确定粘合剂序列
. 通过酶联免疫吸附试验进行亲和力的估计.

材料:
. 大肠杆菌株 BL21(DE3)被用于生产 Bcl-2 蛋白的表达宿主
. 细菌培养基, 胰蛋白胨和酵母提取物都购自Difco (碧迪公司, 富兰克林湖,新泽西州)
. M13肽库筛选试剂盒 (博士噬菌体表达肽库试剂盒)从新英格兰Biolabs (富康,麻州)购得.
. 抗M-13单克隆抗体, 多克隆谷胱甘肽S-转移酶(GST), 抗Bck-2 及抗-Bax 这些特异性抗体都购于圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯, 加州)
. 所有其它的化学品, 包括异丙基-1-半乳糖苷(IPTG)则购自Sigma (圣路易斯,密苏里州).

GST融合蛋白的纯化:
重组Bcl-2(rBcl-2)蛋白质的产生和纯化如同在其它地方描述过的一样. 简单的说, 把Bcl-2蛋白质的成熟形式进一步克隆到pGEX-4T-2质粒(Amersham生物科学公司,皮斯卡塔韦, 新泽西州)内EcoR1和Xho1 的位置(pGEX-4T2-Bcl2), 这样就使得靶蛋白被表达成GST-融合蛋白. 质粒然后被转化进BL21(DE3) E.coli菌株, 培养在含有100微克/毫升氨苄青霉素的1升Luria-Bertani(LB)培养基在37C下, 直到OD600 达到0.7. 然后通过加入0.5mM IPTG 继续在37C下培养4-5小时以诱导细胞超表达靶蛋白. 用离心收获细胞, 产生的沉淀在-80C过夜. 重新悬浮细胞于10毫升磷酸盐缓冲液(PBS, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, pH7.4). 然后置于4C, 用溶菌酶处理, 搅拌30-60 分钟,再用超声波处理. 之后, 4C下用15,000g离心15分钟. 用0.45微米的注射器过滤器过滤去除不溶性的颗粒. 剩下的上清液被装进预先用PBST(PBS 含0.5%TritonＸ-100)缓冲液平衡的GST琼脂糖凝胶柱(Ａmersham 生物科学). 凝胶柱随后用至少三倍柱容量的PBST缓冲液洗. 之后用五倍柱容量的PBS洗以去除多余的ＴritonＸ-100. Bcl-2被用20ｍＭ谷胱甘肽，０.15ＭNaCl，５０ｍＭTris（ｐＨ８.0）以线性梯度洗脱,含有靶蛋白的部分被收集并通过盐柱以去除谷胱甘肽.

制备无GST的蛋白:
根据制造商的说明(Sigma公司), 无GST的Bcl-2(ｒBcl-2)用凝血酶处理的方法产生. 加入1ｍＭ　苯甲脒以终止裂解反应. 无GST蛋白用一个离子交换柱, 单Q(Amersham 生物科学)及0.5MＮaCl线性梯度及25ｍＭ Na-phosphate，ｐＨ7.4 去盐柱纯化. GST-Bcl-2的裂解采用两个不同的能特异性的分别识别GST-标记(抗-GST)和Bcl-2-标记（抗-Bcl-2）的抗体的西方印迹方法证实.

噬菌体肽库的筛选:
博士-12噬菌体表现出的2.7X109肽复杂性的肽库(PhD12, 新英格兰生物实验室公司)被用于筛选. 0.5微克纯化的Bcl-2蛋白被通过疏水作用固定在聚苯板孔里, 然后用2%牛血清蛋白(BSA, 2%牛血清白蛋白于含50mMTris-HCl[pH7.5],150mM NaCl, 0.1%Tween-20的Tris-缓冲的盐水[TBST])在室温下复盖1小时. 这些孔用TBST洗三次, 再用于生物筛选. 一个特定量的噬菌体被加入孔里,在室温下轻轻摇动培养一小时. 然后用TBST 洗这些孔10次.结合的噬菌体在化学洗脱液里洗脱(0.2M甘氨酸[pH2.2],1毫克/毫升BSA). 洗脱物马上用1M Tris-HCl[pH9.1]中和. 在随后的几轮生物筛选(第2- 第5 轮中, TBST里的洗涤剂或盐的浓度增加如下: 0.3%Tween-20(第2轮),0.5%Tween-20(第3轮),0.5%Tween-20 加500mMNaCl(分别为第4和第5轮). 在最后一轮时, 加入额外数量的Bcl-2蛋白使结合的噬菌体被洗脱. 从每一轮洗脱的噬菌体用E.coli ER 2738株进行扩增以便随后的生物筛选有足够的复制本. 在繁殖5小时后, 用11,000g离心15 分钟以去除细菌细胞. 按照制造商提供的程序, 培养上清液用聚乙二醇(20%[W/V]聚乙二醇-800和2.5M NaCl) 沉淀部分纯化了噬菌体.用10,000rpm 速度离心爱30 分钟后, 噬菌体沉淀物重新悬浮于TBS 缓冲液( 50mM Tris-HCl[pH7.5], 和150mM NaCl). 并可用于下一轮的筛选.

DNA测序
培养了一个晚上的 E.coli ER 2738 用LB培养基稀释成1: 100, 并分成1毫升的小等份. 加入能显示Bcl-2结合肽的单个噬菌体. 细胞在37C培育5 小时, 然后离心收集含有噬菌体的上清液. 加入200微升PEG/NaCl(20% [W/V] 聚乙二醇-800 和 2.5M NaCl)以沉淀噬菌体. 用碘缓冲液(含10mM Tris-HCl[pH8.0], 1mMEDTA, 4MNaI) 重新悬浮由此产生的沉淀, 然后用酒精沉淀. 噬菌体的单链DNA由此获得并溶于dH2O(蒸馏水), 噬菌体的单链DNA序列用拥有96 Pill测序引物的自动序列测定服务(Macrogen 公司, 首尔, 韩国)测定. 用新英格兰生物实验室提供的遗傳密码资料推测出肽的氨基酸序列.

酶联免疫吸附试验估计结合亲和力:
制备能表达Bcl-2 结合肽的噬菌体, 并以测量噬菌体形成单位(pfu)来决定其浓度, 当进行肽结合亲和力估计时, 表达Bcl-2结合肽的噬菌体被如同指出的以浓度依赖方式加入含有Bcl-2蛋白(0.5微克/孔)的96孔平板. 随后用TBST洗这些孔10次. 室温下用一个抗-M13抗体(鼠单克隆抗体, 1:5000稀释于TBST, 0.2微克/毫升, Amersham生物科学公司)探查1 小时. 用TBST 缓冲液洗5次后, 抗鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)结合物被加进并培育1小时. 用TMB底物溶液(3,3’,5,5’-四甲基苯唑啶[TMB]/过氧化氢, Chemicon公司, 比尔里卡, 麻州)进行显色反应. 15分钟后, 加入1 M硫酸以终止反应. 用一个Biotrak 多孔平板阅读仪(Amersham,生物科学) 在450nm处测定光密度. 另外, 一系列稀释的用生物酰化的/或FITC-标记的肽被Bcl-2蛋白固定于96孔平板培育 2小时.结合到靶蛋白的生物酰化的肽通过与链霉亲和素-HRP抗体共育(稀释在1:1000TBST, BD Pharmingen, 圣迭戈, 加州)而检测出来. 而FITC-标记的肽的结合亲和力由有一在495nm激发和在520 nm发射的最大软V5系统的荧光微板阅读仪(Molecular Devices, 桑尼维尔, 加州)测定.

★ 请关注《美中药源》微信公众号 ★