CCR2拮抗剂对人类原发性单核细胞（增多症）的高含量分析

【应用范围】: 炎症
【理由】: 单核细胞趋化蛋白 1 (MCP-1) – 驱动CC型趋化因子受体 2 (CCR2)活化是一个诱导单核细胞向炎症中心迁移的早期关键步骤之一.

本实验使用部分自动化液体处理, 自动荧光显微成像, 及一个特异的图像分析算法来分析内在的MCP -1进入人类单核细胞. MCP -1荧光标记形式被单核细胞快速地吞噬并保留. 内在的MCP -1 的CCR2依赖性同过BMS CCR222, CCR2 特异性的拮抗剂的使用而证明. 一系列小分子CCR 2拮抗剂的明显抑制能力被测定, 并用5 种检测格式进行比较, 包括在本项工作中所描述的高含量分析测定. 有趣的是, 在五个读数系统中, 一些, 但并非全部的拮抗剂显示出明显不同的抑制行为. 其中在最高和最低的明显抑制能力之间的差异, 最高可超过100倍. 这些发现产生了明显的可能性, 即一些CCR2拮抗剂能在CCR2受体不同的功能状态之间进行辩别. 并提出对于非选择性拮抗剂而言,功能性选择的CCR2拮抗剂将增加治疗性的优势的策略.

【实验材料】：
Ficoil-Paque PLUS (货号17144002) 来于GE Healthcare Bio-sciences (Little Chalfont UK). 单核细胞分离试剂盒II (货号130091153) 和磁珠分离LS色谱柱(货号130042401) 均购自Miltenyi Biotec(Auburn, CA). 杜尔贝科磷酸盐缓冲液(PBS)无钙无镁(1XD_PBS, 货号H15-002)是从PAA Laboratories (Pasching, Austria). EDTA (Versen)1% (W/V) 在无钙无镁的PBS(货号L2113)及在有钙有镁的PBS (货号称L1815). 杂交瘤DIF1000(货号F8055)来于Biochrom AG(Berlin, Germany). 牛血清白蛋白(BSA, 货号A8327 和A3059),皂素(货号54521), 碳酸氢钠溶液(7.5%[W/V], 货号58761),甲醛(37%[W/V]水溶液, 货号252549) 均购自Sigma Aldrich (St.Louis, MO). BD CellFIX 溶液购自BD Biosciences (BD；Franklin Lakes, NJ). 此外, 汉克氏缓冲盐溶液(10X HBSS; 货号14065-049), 1Ｍ４-［２-羟乙基］-１-哌嗪-乙醇磺酸（HEPES［肝素钠］，货号15630-056）．杜尔贝科＇氏PBS　含钙和镁（１ＸＤ-PBS，货号14190-094），和Hoechst 33342(10毫克/毫升, 货号H3570)购自Invitrogen (CarIsbad, CA). 血色染色盒(货号1.1674.0001) 购于Merck Chemicals (Darmstadt, Germany). 无标记的人类单核细胞趋化蛋白-1(hMCP-1/CCL2;, 货号300-04) 购于Pepro Tech Gmb4 (Hamburg, Germany), 125I-标记的hMCP-1(货号NEX332005; 特异活性81.4 TBq/nmol)购自Perkin Elmer Life and Analytical Sciences(Waltham, MA). Alexa Flour 647-标记的hMCP-1(hMCP-1_AF647, 货号CAF-02)购自Almac Sciences(Edinburgh, UK). 参考抑制剂BMS CCR2 22 (货号3129)购于Tocris Bioscience (Bristol, UK). 藻红蛋白(PE)-标记的鼠抗人类CD14抗体(货号555398)从BD Biosciences 购得. OEHS-型(四极激发高灵敏度)音响HCA 阅读仪购自Evotec Technologies (Hamburg, Germany, 现在是PerkinElmer Life and Analytical Sciences 的一部分). 细胞内分析仪3000是购于GE Healthcare BioSciences(Little Chalfont, UK). BD 384 孔板(黑色/透明, 带盖的组织培养[TC]皿, 底部750微米,货号350504). 一个定做的BD BioCoat 胶原 1 型细胞器皿, 384 孔厚底平板与细胞内分析仪 3000成像配套都购自BD BioSciences, 而为音响HCA阅读仪成像所定做的胶原 1 型涂层的384孔平板则购自Evotec Technologies. FLIPR 4 是从Molecular Devices(Sunnyvale , CA). Fluo-4 AM (货号F1420)来于Invitrogen. 趋化测验用的一次性趋化探针系统(5 微米孔径, 货号116-5) 购于Neuro Probe (Gaithersburg, MD),和 OptiPlate-96(货号6005290)购自PerkinElmer Life and Analytical Sciences 与从Promega(Medison, WI) 购买的CellTiter-Glo 荧光细胞活性检测(货号G7571)结合使用. 至于125 I-hMCP-1hCCR2 SP A 结合试验, 聚乙烯甲苯小麦胚芽凝集素闪烁珠(PVT-WGA珠, 货号RPNQ0001)购于 GE Healthcare. 一株人类急性单核细胞白血病细胞(THP-1 细胞, DSMZ 号码ACC16)获自DSMZ 有限公司(Braunschweig, Germany). 这株THP-1细胞被培养在含有GlutaMAX 和25 mM 肝素钠(货号72400-021)的RPMI 1640培养基, 辅以1%(V/V)非必须氨基酸(NEAA, 货号11140-035)及10%(V/V)小牛血清(FCS, 货号称0500-064)来于Invitrogen. 所有其它的材料都是市场上可以买到的最高等级.

半自动化hMCP-1_AF647在初级人类单核细胞的内部检测:
使用Ficoll-Paque Plus离心机把从徳国红十字会在乌尔姆的血库里获得的人类棕黄色血清上层制备品用密度梯度离心方法分离出外周血单核细胞(PBMCs). 按照生产商提供的程序, 用单核细胞分离包II(购自Miltenyi Biotec)去掉非单核细胞(阴性选择).无损的单核细胞由此而制备. 分离的单核细胞纯度用制备的细胞离心涂片的Hemocolor染色来测定. 新鲜分离的单核细胞用一个有8个通道的吸量器置于涂有1型胶原蛋白的384孔测定平板(APs). 每孔 30微升测定缓冲液(1 X HBSS, 10mM肝素钠, 0.0375%[W/V]碳酸氢钠, 及0.1%[W/V]BSA), 细胞密度25,000细胞/孔. 用盖子盖住的APs在37C及5%(V/V)二氧化碳中培养60分钟. 复合物来源的平板(CSPs)用在100% DMSO中的测试的化合物做一个3.16倍系列稀释而制备. 之后, CSPs复合物被稀释1:200于复合缓冲液(1X HBSS, 10mM 肝素钠, 0.0375%[W/V]碳酸氢钠), 再用CyBi-384孔同步吸液器(CyBio AG, Jena, Germany)放入复合缓冲液稀释板(CBDP). 然后,用CyBi-384孔同步移液器把10微升/孔的稀释的测试复合物从CBDP移到AP. 把AP放在室温下培育30分钟, 再以10微升/孔的量加入测试缓冲液里的hMCP-1_AF647, 调整hMCP-1_AF647 的浓度到10nM, 就象在这种情况下通过滴定hMCP-1_AF647到载体预处理的初级单核细胞的上清液进行测定那样,这是这个试验及HCA和全血测定的近似的EC值80. 随后在5%[V/V]CO2及37C下培育一个指定的时间段或者象最后程序一样培育45分钟. 含有最终浓度为10nM hMCP-1_AF647和0.1%(V/V)DMSO的孔作为阳性对照(“高”),而辅以1uM参考拮抗剂BMS CCR2 22和10nM 激活剂的作为阴性对照(“低”). 细胞在室温下用含4%甲醛的PBS固定,而核用1uM Hoechst 33342染色, 随后细胞储存于4C. 通过使用364-nm激光进行Hoechst 33342染料的荧光激活及647-nm激光激发AF647/hMCP-1信号而在IN Cell分析仪3000进行成像.

【 图像分析】:
hMCP-1_AF647内部检测:

IN Cell分析仪3000的荧光成像是用载于IN Cell分析仪3000的分析软件粒度算法(GRN2)进行图像分析. 简言之,在蓝色(核)通道中当像素积累超过一个特异的强度阈值时, GRN2算法识别核. 在这些核周围, 一个特别扩张的”细胞质”复盖地区, 一个预先设定的大小和强度的颗粒相对应于内在的激动剂被鉴定. 这些颗粒的F值按以前描述的进行计算.

MCP-1诱导的在初级人类单核细胞胞质内钙离子的增加：

初级人类单核细胞如同以上描述的从健康献血者的缓冲液涂层的制备品中分离.在加入带有钙指示剂Fluo-4 AM的单核细胞后，细胞质内的钙离子浓度的改变用ＦLIPR Tetra测定．其激发波长为４70-490 nM, 发射波长为515-575nM．荧光测量的头２秒被用来检测基线．移液系统适用于测定在培育１８０秒后不同浓度的复合物．然后，细胞用１0nM MCP-１处理（当测到细胞质内钙离子增加时，测定的MCP-1的ＥＣ８０值是８nM, 为简便，并增强这个测定与HCA和全血测定的一致性，选定１０nM增强剂．对以后的荧光标记的MCP-1结合的抑制的２种形式用ＥＣ８０值确定浓度）．测定复合物的明显抑制能力的定量，　在加入MCP-1后信号强度被整合成８３秒．

ＴＨＰ－１细胞的趋化
由悬浮在检测培养液（Hybridomed DIF 1000 含５％［Ｗ／Ｖ］ＨＳＡ在有钙离子和镁离子的ＰＢＳ里）的ＴＨＰ－１细胞于浓度为７Ｘ１０６细胞／毫升时进行趋化测定．用测试化合物处理过的细胞在指定的浓度下，５％［Ｖ／Ｖ］ＣＯ２，３７Ｃ３０分钟．Ｃhemo TX 板的下层注入了测试培养液其中含有有趋化能力的hMCP-1（８００pm）ＥＣ８０．然后，　５００，０００被化合物处理过的细胞被置于聚碳酸酯过滤器的顶部．整个ChemoTX板被置于５％［Ｖ／Ｖ］ＣＯ２下在３７Ｃ培养３小时．测试化合物介导的趋化性拮抗通过使用CellTiter-Glo荧光活性检测，测出在１００微升细胞悬浮液里的细胞数量进而确定趋化的拮抗作用。

在人类全血中hMCP-1_AF647 结合CCR2：
来于健康捐赠者的８４微升人类全血用１６微升ACD缓冲液（７５mM 柠檬酸钠，３８mM柠檬酸，１２０mM葡萄糖，pH 6.5）抗凝．然后１微升不同浓度的测试化合物被加入，　混合物被培养在３７Ｃ加有５％［Ｖ／Ｖ］ＣＯ２１５分钟．接下来，９９微升含有hMCP-1_AF647(最终浓度１０nM，即近似于ＥＣ８０的浓度，用滴定来确定就象在上面ＨＣＡ内部测试中描述的那样)的工作溶液加入，一种ＰＥ－标记的抗人类ＣＤＨ抗体（最终稀释度为１：３６０）加入样本，接着培养混合物于３７Ｃ含有５％｛Ｖ／Ｖ｝ＣＯ２条件下６０分钟．将样本离心(1200转/分 5分钟, 4C), 加入1200微升溶解溶液(155mM NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA)使红细胞溶解, 随后把混合物在冰上培育30分钟. 在用HBSS(无钙离子和镁离子,补充有20mM肝素钠, 0.2%[W/V]BSA, pH7.4)洗涤俩次后,剩余的细胞通过重新悬浮于BD CellFIX溶液(1:10稀释于PBS)而固定. 用BDLSRII流动细胞仪及其633nm和488nm激发波长来测定细胞的荧光. 丢弃对PE-标记的CD14显示阳性的细胞. 在这个群体中, 只有对hMCP-1_AF647显示阳性的细胞才用BD FACS Diva软件进行计数和分析.

放射性标记的hMCP-1 结合到THP-1细胞膜(闪烁近似检测[SPA])
THP-1膜的粗糙膜制备品含有CCR2被用测试缓冲液(25mM 肝素钠/氢氧化钠,pH7.2, 5mM MgCl2; 0.5mMCaCl2; 和0.2% [W/V]BSA)调整到5微克蛋白质/微升的浓度. PVT-WGA-SPA珠子则用测试缓冲液稀释到8毫克珠子/毫升的浓度.

膜和珠子的准备: 细胞膜和珠子用1:2[V/V]的比例在室温下用从一端到另一端的旋转方式培育30分钟.测试化合物用100%DMSO溶解到10mM的浓度, 再进一步用100%DMSO稀释到1mM. 所有添加的化合物都用测试缓冲液稀释. DMSO的最终稀释浓度是1%[V/V].化合物和膜,珠悬浮液与100pM 125-IhMCP-1(<25,000cpm/10微升)一起培养. 在无拮抗剂的情况下,80%的受体应该被饱和. 6 小时后,结合的放射活性用一beta计数器来确定. 试验化合物的亲和力通过实验数据的曲线拟合及GraphPad Prism软件版本4.03应用Cheng-Prusoff校正推导出一个明显的分离平衡常数Ki 计算而确定.

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