ADC到底是什么？（九）旁观者何时被杀伤

因为肿瘤结构复杂、药物尤其是大分子药物浸润难度比较大，加上肿瘤抗原暴露比较有限、有些肿瘤细胞可能根本就不表达靶点抗原，所以ADC毒素的旁观者杀伤效应是现代ADC的一个重要性质。但是旁观者杀伤的具体机制现在还并不十分清楚，一个重要原因是肿瘤微环境很难模拟，体外实验、甚至动物体内实验都很难真正复制患者肿瘤微环境的复杂情况。

ADC毒素释放后可能很快逃离了毒素释放细胞、立即开始杀伤旁观者，也可能等毒素释放细胞被杀死后跟随其它细胞内物质被释放到肿瘤微环境继续杀伤其它肿瘤细胞，具体是在哪个阶段开始的旁观者杀伤与毒素进出细胞膜速度、靶点浓度、毒素与靶点结合力有关。

毒素在细胞内释放后穿过细胞膜一般认为遵循一级动力学，即逃离速度与药物浓度成正比。据阿斯利康科学家最近的研究显示，DXd离开肿瘤的动力学常数K为0.7/小时、即一半DXd从肿瘤离开需要约1小时（t1/2=0.693/K）。但此前有研究估计这个时间只需要1分钟，估计与具体哪类肿瘤细胞有关。无论是1分钟还是1小时都显著短于DXd杀死肿瘤细胞所需要时间（几天甚至更长），所以DXd从ADC中被释放后可能并没有时间杀死毒素释放细胞再去杀死其它肿瘤细胞，而是立刻加入微环境敢死队开始无差别杀伤。

有些毒素虽然可以快速逃离细胞，但也可能高强度与靶点蛋白结合，当靶点蛋白浓度较高时（比如微管和DNA）大量毒素会被吸附在靶点蛋白上因此影响旁观者杀伤。在真实肿瘤微环境中从毒素释放细胞中逃离不等于就可以远离这个细胞，因为即使小分子毒素要穿越肿瘤复杂组织也不容易，但这类研究并不多、所以旁观者杀伤动力学也信息较少。密歇根大学的Thurber教授在这方面做过不少基础研究，有助于我们理解旁观者杀伤。

因为体内实验比较复杂，他们构建了一个三维体外系统（spheroid），利用这个体系评价了常用毒素的旁观者杀伤效应。ADC可以用绿色荧光标记、毒素杀伤效应则用组蛋白损伤作为代替信号（红色gH2A.X），从图1可以看到在实验早期杀伤信号（但不一定是已经杀死、只是中弹了）主要在spheroid的边缘。

图1.

但随着毒素杀红了眼，spheroid内部没有与抗体结合的肿瘤也大量中弹（但未必死亡）。所以在这个体系中ADC是优先杀伤毒素释放细胞的（图2）。但spheroid是个人工系统、毒素在这个系统中穿行速度可能较慢，即虽然毒素可以快速离开毒素释放细胞、但却不能快速浸润到spheroid内部，所以还是优先杀伤了毒素释放细胞。在扩散动力学中有一个叫做Damkohler数的参数描述毒素释放与在组织中穿行的相对速度，据模型推算DAR4 ADC在2.5 mpk剂量下这个参数~3时旁观者杀伤效应最强，DXd为0.85、Lys-MSS-DM1则是0.01。

图2.

但spheroid结构与肿瘤微环境是不同的（比如没有血流、血管、其它供给通道），那么在小鼠肿瘤微环境中旁观者杀伤动力学是怎样的呢？这个实验显然更难做，所以作者只做了一个时间点（72小时）。从图3可以看出，至少在72小时的时候毒素杀伤（红色荧光）已经不仅限于ADC（TAK164）能到的区域了、即旁观者杀伤已经与毒素释放区域（绿色荧光）没有明显区别了。那这是否说明在小鼠肿瘤微环境中毒素可以更快穿透组织、能更有效实现旁观者杀伤呢？

图3.

作者又做了一个实验，这个实验比较ADC（TAK164）、Fc静默TAK164、单抗阻断靶点抗原+ TAK164、以及单抗阻断靶点抗原+ Fc静默TAK164四种条件下的旁观者杀伤。从图4可以看到TAK164可以杀伤ADC不能浸润区域的肿瘤（第一列），但这似乎不是靶点抗原(GCC)介导的，因为静默Fc后虽然TAK164可以大量进入微环境（绿色）但杀伤力大减（红色，第二列）。而靶点被单抗饱和后虽然TAK164失去进入微环境通行证，但杀伤力却与第一列无异（第三列）。当然同时用单抗阻断靶点并静默Fc后TAK164对就肿瘤视而不见了（第四列）。

图4.

所以在小鼠肿瘤微环境中毒素是可以进行无差别杀伤的（至少在一定时间内），但这似乎并不是来自与靶点抗原的仇恨，而是微环境中有人通过Fc受体暗中煽风点火。

在小鼠模型研究旁观者杀伤效应已经很难，在患者研究就更难了。患者参与临床试验主要是为了得到优先治疗机会、顺便证明新疗法的疗效和毒性，药物工作机制对患者、甚至医生来说并不重要。目前最有价值的一个临床研究是T-DXd的DAISY试验，其中一部分是比较使用T-DXd产生应答患者疾病进展后的HER2变化。从这个图5可以看到T-DXd进展后有65%患者HER2下降、但下降并不明显，另有35%肿瘤顶风作案，HER2或者没变或者增加。这个结果有多种可能，但其中一个可能是T-DXd并没有优先杀伤HER2阳性肿瘤细胞。DXd在杀伤毒素释放细胞前已经离开该细胞进入微环境开始无差别杀伤，敏感细胞杀光后疾病进展，留下很多HER2阳性细胞等待新一代ADC的出现。这也与ADC毒性主要以脱靶毒性为主一致，即毒素释放细胞并不会被ADC优先杀伤、而仅仅起到一个引狼入室的功能。

图5.

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